Mesenkymale stamceller

Blandt de regionale stamceller indtager mesenkymale stamceller (MSC'er) et særligt sted, hvoraf derivaterne udgør stromalmatrixen af alle organer og væv i menneskekroppen. Prioritet i MSC's forskning tilhører repræsentanter for russisk biovidenskab.

I midten af sidste århundrede blev en homogen kultur af multipotente stromale knoglemarvstamceller først isoleret i laboratoriet af A. Friedenshtein. Mesenchymstamceller bundet til et substrat i lang tid bevaret en høj proliferationshastighed, og kulturer ved lav udsåningstæthed efter fiksering på et substrat fremstillet af fibroblast-cellekloner, der ikke har fagocytisk aktivitet. Stoppet af MSC proliferation resulterede i deres spontane in vitro differentiering i knogle-, fedt-, brusk-, muskel- eller bindevævsceller. Yderligere undersøgelser har gjort det muligt at etablere det osteogene potentiale af fibroblastlignende celler i knoglemarvsstroma hos forskellige pattedyrsarter såvel som deres kolonidannende aktivitet. I eksperimenter in vivo blev det vist, at både hetero- og orthotopisk transplantation af fibroblast kolonidannende celle er fuldført dannende knogle, brusk og fibrøst fedtvæv. Eftersom knoglemarvs stamceller har en høj kapacitet til selvfornyelse og en række differentieringer inden for en enkelt cellelinje, er de blevet betegnet multipotente mesenchymale stamceller.

Det skal bemærkes, at i 45 års grundforskning af mesenkymale stamceller er der skabt reelle betingelser for brug af deres derivater i klinisk praksis.

I dag er der ingen tvivl om, at alle væv fra den menneskelige krop dannes af stamceller fra forskellige cellelinjer som følge af proliferationsprocesser, migration, differentiering og modning. Men for nylig blev det antaget, at stamceller i den voksne krop er vævsspecifikke, det vil sige kun at producere specialiserede cellelinier kun af vævene, hvori de er placeret. Denne konceptuelle situation blev afvist af fakta om transformation af hæmatopoietiske stamceller, ikke kun i cellulære elementer af perifert blod, men også til ovalle leverenceller. Desuden var neurale stamceller i stand til at give anledning til både neuroner og glial elementer, såvel som tidligt engagerede linjer af hæmatopoietiske stamceller. Til gengæld er mesenkymale stamceller, som normalt producerer cellulære elementer af knogle, brusk og fedtvæv, i stand til at omdanne til neurale stamceller. Det antages, at i vækstprocessen, fysiologisk og reparativ vævregenerering, frembringes ubestemte stamceller fra vævsspecifikke stamreserver. For eksempel kan reparation af muskelvæv realiseres ved hjælp af mesenkymale stamceller, som migrerer fra knoglemarv til skeletmuskler.

Selv om sådanne indlæg ombyttelighed stamceller genkender ikke alle forskere mulighed for klinisk anvendelse af de mesenkymale stamceller som en kilde til celle transplantation og celle vektor af genetisk information ikke har bestridt som multipotente stromale knoglemarvsstamceller, som kan være relativt let at isolere og udbreder i kultur in vitro. Samtidig i den videnskabelige litteratur fortsat vises rapporter om potentialet af pluripotente stamceller i knoglemarven stroma. Som beviser præsenteret forsknings- protokoller, som under indflydelse af specifikke inducere af transdifferentiering af MSC'er omdannes til nerveceller, cardiomyocytter og hepatocytter. Men nogle forskere mulighed for at re-aktivering og genekspression under tidlig embryogenese i alvorlig tvivl. Samtidig, alle forstår, at hvis forholdene er fundet at udvide multipotente mesenkymale stamceller til pluripotens af økonomiske og sociale råd i regenerativ medicin og plast automatisk løst mange problemer i etiske, moralske, religiøse og juridisk karakter. Eftersom i dette tilfælde kilden til stilken regenerativ kapacitet af patienten er autologe stromale celler er løst, og problemet med immun afstødning af celle transplantation. Hvor virkelige disse udsigter er, vil den nærmeste fremtid vise.

[1], [2], [3], [4]

Anvendelse af mesenkymale stamceller i medicin

Klinikken anvendelsen af derivater af mesenchymstamceller er forbundet primært med reduktionen af vævsdefekter forårsaget af omfattende og dybe termiske læsioner af huden. Præklinisk eksperimentel evaluering af hensigtsmæssigheden af allogene fibroblastlignende mesenchymstamceller til behandling af dybe brandsår blev udført. Det er vist, at de fibroblastlignende knoglemarvsceller mesenchymstamceller danne et monolag i kulturen, hvilket gør det muligt at transplantere dem at optimere regenerering af dybe brandsår. Forfatterne bemærker, at lignende egenskaber har embryonale fibroblaster, men den kliniske anvendelse af sidstnævnte er begrænset til de eksisterende etiske og juridiske problemer. Dybe forbrændinger med PWA-bekræftes af alle lag af huden modelleret på Wistar-rotter. Forbrændte område var 18-20% af den samlede hudoverflade. I den første forsøgsgruppe bestod af rotter med dyb termisk skade og transplantation af allogene fibroblast-afledte mesenchymal-stamceller. Den anden gruppe bestod af dyr med dybe termiske forbrændinger og trans-plantage af allogene embryonale fibroblaster. Den tredje gruppe af kontrolrotter blev leveret med dyb termisk skade, som ikke udføre celleterapi. En suspension af fibroblastafledte mesenkymale stamceller og embryonale fibroblaster blev påført en brænde såroverflade pipetteret i en mængde på 2 x 10 ⁴ celler på 2. Dag efter udskæring af brænde modellering og nekrotisk skorpe dannet. Efter transplantation, celler brænde overflade er dækket med gaze gennemvædet i isotonisk natriumchloridopløsning med gentamicin. Fence knoglemarvsceller til opnåelse MSC'er med efterfølgende induktion af fibroblast linie i mesenchymstamceller produceret i voksne Wistar-rotter fra femur. Føtale lungefibroblaster blev opnået fra 14-17 dage gamle embryoner. Embryonale fibroblaster og knoglemarvsceller at opnå en præ-MSC'er blev dyrket i petriskåle ved 37 ° C i en C02 iikubatore, i en atmosfære med 5% CO2 ved 95% fugtighed. Embryonale fibroblaster dyrkes i 4-6 dage, hvorimod MSC for monolagdannelse kræves fra 14 til 17 dage. Efterfølgende MSC'er opretholdes ved kryokonservering som udgangsmateriale til fibroblastafledte mesenkymale stamceller, som blev fremstillet ved optøning og dyrkning MSC'er i 4 dage. Antal fibroblast-genereret mesenkymale stamceller er mere end 3 gange antallet af embryonale fibroblaster, der opstår under den samme kultur periode. For at identificere celler i transtslantirovannyh brandsår i trin dyrkning deres genom mærket under anvendelse viral shuttle-vektor baseret på en rekombinant adenovirus V typen carrier 1AS-2-genet, der koder for ß-galactosidase E. Coli. Levende celler på forskellige tidspunkter efter transplantation påvises immunhistokemisk i kryosektionerne med tilsat substrat X-Gal, hvilket giver den karakteristiske blå-grøn farve. Som et resultat af visuel dynamik, planimetriske og histologisk evaluering tilstand brandsår, blev det konstateret, at selv på den 3. Dag efter transplantation af cellerne i isolerede grupper synes signifikante forskelle i sårhelingen. Tydeligst denne forskel er 7 dage efter celle transplantation. Dyrene i den første gruppe, som blev transplanteret fibroblastlignende mesenchymstamceller, sår erhvervet ensartet rosenrødt intens farve, granulationsvæv vokset over hele dets areal til niveauet af overhuden, og brænde overfladen er reduceret betydeligt i størrelse. Adskillige dannet tyndere collagen film på såroverfladen, men hun fortsatte med at dække hele arealet af brænde. Dyrene i den anden gruppe, som blev transplanteret embryonale fibroblaster, er granulationsvæv løftes til niveauet for epidermis af sårkanterne, men kun i nogle steder, samtidig plazmoreya fra såret var mere intens end i gruppe 1, og indledningsvist dannede collagen film stort set forsvundet. Hos dyr, som ikke modtog behandling med stamceller, på 7. Dag brandsåret var en bleg, pitted, nekrotisk væv, overtrukket med fibrin. Plasmorrhea blev noteret gennem brændeoverfladen. Histologisk de dyr af 1. Og 2. Grupper viste et fald på cellulær infiltration og udvikling af karrene, har disse tegn på begyndende regenerator proces været mere alvorlig i rotterne i gruppe 1. I kontrolgruppen viste tegn på celle viklet infiltrationen, histologiske mønster af nyligt dannede blodkar fraværende. 15-30 th dag for observation dyrene i 1. Gruppe brænde overfladearealet var signifikant mindre end i rotterne i andre grupper og granulering overflade var mere udviklet. I dyrene i brænde overfladeareal 2. Gruppe er også faldt sammenlignet med størrelsen af brandsår i kontrolgruppen af rotter, der skyldtes marginal epitelisering. I kontrolgruppen forblev gruppens burn overflade sites blege granulationer med sjældne, optræder derpå karsprængninger, holme var fibrinøs plak fortsat moderat plazmoreya tværs brænde overflade, noget som er svært aftagelig sårskorpe tilbage. Generelt dyr i gruppe 3 reducerer også størrelsen af såret, men såret forblev podrytymi kant.

Således, under en sammenlignende undersøgelse af sårheling hastigheder ved fibroblast-afledte mesenchymal stamceller og føtale fibroblaster og uden anvendelse af celleterapi mærket fremskyndelse af heling af brandsår overflade som et resultat af transplantation af fibroblastafledte mesenkymale stamceller og embryonale fibroblaster. Men i tilfælde af anvendelse af allogene Mesenchymstamceller fibroblast sårhelende var højere end i transplantation af embryonale fibroblaster. Dette manifesterede sig hurtigere ændringer af restitution faser af processen - at reducere cellulær infiltration perioder, øger hastigheden af proliferation af vaskulære netværk samt dannelsen af granulationsvæv.

Resultaterne af dynamisk planimetri indikerer, at hastigheden af spontan heling af brændsåret (uden brug af celleterapi) var den laveste. Den 15. Og 30. Dag efter transplantationen af allogene Mesenchymstamceller fibroblast sårhelende var højere end i transplantation af embryonale fibroblaster. Histokemisk fremgangsmåde til påvisning af beta-galactosidase viste, at efter transplantation af fibroblastlignende mesenchymale stamceller og embryonale fibroblaster i hele observationsperioden på overfladen og dybe regenererende sår transplanterede celler forbliver levedygtige. Forfatterne foreslår, at en højere brandsår regenerering under anvendelse af mesenkymale stamceller af fibroblastkonditioneret frigivelse af disse celler under modning rostostimuliruyushih bioaktive faktorer.

Transplantation af autologe eller allogene keratinocytter og allogene fibroblaster til behandling af brandsår og anvendes i klinikken. Det skal bemærkes, at kirurgisk behandling af børn med omfattende dybe brandsår er en kompliceret opgave grundet den høje mangfoldighed af traumer og kirurgiske indgreb, betydeligt blodtab, om de forskellige reaktioner, der anvendes infusion medier. De største vanskeligheder ved gennemførelsen af hud og plastikkirurgi med omfattende dybe forbrændinger, området over 40% af kroppens overflade, på grund af sværhedsgraden af hendes tilstand og manglen på ressourcer donorhud. Brugen af mesh podninger med stor perforering forholdet løser ikke problemet, da billedet efter epiteliziruyutsya celle perforering er meget langsom, og ofte gør hudtransplantationer lyseres eller tørt. Sådanne overtræk brandsår som ksenokozha, kadaver-allografter, syntetiske filmovertræk er ikke altid tilstrækkelig effektiv, så udvikling af nye metoder til lukning af brænde overfladelag af dyrkede keratinocytter og fibroblaster. Især en fremgangsmåde til lukning brænde overflader ved hjælp af dyrkede allofibroblastov tilvejebringer under transplantation udtalt stimulerende virkning på proliferationen epidermotsitov bevaret i såret grænsen ved forbrændinger, og i keratinocyttransplantater mesh baner. I arbejdet hos L. Budkevich og medforfattere (2000) præsenteres resultaterne af anvendelsen af denne metode til behandling af forbrændinger hos børn. 31 børn med termisk traume i alderen 1 til 14 år var under observation. På tre børn samlede areal brandsår IIIA-B - IV grad var 40%, 25 - 50-70%, selv på tre - 71-85% af kroppens overflade. Tidlig kirurgisk nekrosektomi blev kombineret med transplantation af dyrkede allof fibroblaster og autodermoplasty. I det første trin behandlingen blev udført nekrotisk væv udskæring, den anden - på transplantation af dyrkede allofibroblastov bærefilm, den tredje (48 timer efter transplantation af dyrkede allofibroblastov) - fjernelse af matrix og hudlapper med autodermoplasty perforering forhold på 1: 4. Tre patienter indlagt til klinikken med en alvorlig forbrændings sygdom, dyrkede allof fibroblaster blev transplanteret til granulerende sår. Transplantation af dyrkede allo-fibroblaster blev udført en gang hos 18 børn, to gange i 11 og tre gange hos to patienter. Området af såroverfladen dækket af cellekulturen var fra 30 til 3500 cm2. Effektivitet af dyrket allofibroblastov evalueret af det samlede indhold af indpodning af hudlapper, tidspunkt for heling af forbrændinger og antallet af dødsfald alvorlig termisk skade. Engraftment af transplantationer var fuldstændig hos 86% af patienterne. Et partielt ikke-udseende af hudflapper blev noteret i 14% af tilfældene. På trods af igangværende behandling døde seks (19,3%) børn. Det totale hudlæsionsareal i dem var fra 40 til 70% af kropsoverfladen. Transplantation af dyrkede allo-fibroblaster var ikke relateret til det fatale resultat af en forbrændingsskade hos nogen patient.

Analysere resultaterne af behandlingen, bemærker forfatterne, at tidligere brænder uforenelig med liv, til at behandle dybe termisk beskadigelse af området på 35-40% af kroppens overflade (for små børn hud - op til 3 år - er kritiske dybe forbrændinger med et areal på 30%, for ældre børn alder - over 40% af kropsoverfladen). Når den kirurgiske transplantation af dyrkede necrectomy allofibroblastov autodermaplasty og efterfølgende hudtransplantater med store brandsår, perforering faktor III B - IV grad forbliver kritisk, men i øjeblikket er der perspektiver i mange tilfælde at redde livet for selv sådanne ofre. Kirurgisk necrectomy sammenholdt med transplantation af dyrkede allofibroblastov og autodermaplasty hos børn med dybe brandsår viste sig at være særlig effektiv i patienter med fremskredne læsioner af huden med et underskud på donorsteder. Aktiv kirurgisk taktik og omplantning dyrkede allofibroblastov fremme en hurtig stabilisering af den generelle tilstand af sådanne patienter, reduktion i antallet af infektiøse komplikationer af brænde sygdom, skabe gunstige betingelser for transplantation, reducere den tid at genoprette den tabte hud og varigheden af hospitalsbehandling, reducere forekomsten af dødsfald hos patienter med omfattende brandsår. Således transplantation af dyrkede allofibroblastov efterfulgt autodermaplasty hudlapper opnår opsving i børn med alvorlige forbrændinger, der tidligere blev betragtet dømt.

Det er almindeligt accepteret, at prioriteringen behandling af brænde sygdom er den mest komplette og hurtig genopretning af beskadiget hud til at advare følge af denne toksiske virkninger, infektiøse komplikationer og dehydrering. Resultaterne af anvendelsen af dyrkede celler afhænger i høj grad af beredskabet til transplantation af selve brænde såret. I tilfælde af transplantation af dyrkede keratinocytter til såroverfladen efter kirurgisk necrectomy prizhivlyaetsya et gennemsnit på 55% (efter område) af transplanterede celler, mens det granulerende sår inkorporeringsgraden er reduceret til 15%. Derfor kræver en vellykket behandling af omfattende dybe hudforbrændinger i første omgang aktiv kirurgisk taktik. I nærvær af brandsår IIIB-IV grad brænde flade umiddelbart befriet for nekrotisk væv for at reducere fænomenerne beruselse og reducere mængden af brænde sygdomskomplikationer. Anvendelsen af sådanne taktik er nøglen til at reducere den tid fra tidspunktet for brænding til sårlukning og ophold af patienter med omfattende forbrændinger i et hospital, men også reducerer antallet af dødsfald betydeligt.

De første rapporter om den vellykkede anvendelse af dyrkede keratinocytter til at dække brændeoverfladen optrådte i begyndelsen af firserne af det sidste århundrede. Derefter blev denne manipulation udført ved hjælp af lag af kultiverede keratinocytter, opnået oftest fra autoceller, meget mindre ofte fra allokeratinocytter. Teknologien til autokeratinocytoplasti tillader imidlertid ikke oprettelsen af en cellebank, mens den tid, der kræves for at producere et tilstrækkeligt transplantat fra keratinocytter, er stort og beløber sig til 3-4 uger. I løbet af denne periode øges risikoen for at udvikle infektiøse og andre komplikationer af brænde sygdom kraftigt, hvilket signifikant forlænger patientens samlede opholdstid på hospitalet. Desuden overlever autokeratinocytter praktisk taget ikke under transplantation til granulerende brændsår, og de høje omkostninger ved særlige vækstmedier og biologisk aktive keratinocytvækststimulerende midler begrænser signifikant deres kliniske anvendelse. Andre bioteknologiske metoder, såsom kollagenplastik, transplantation af kryopreserverede xenoider og anvendelsen af forskellige biopolymercoatinger øger effektiviteten af behandling af omfattende overflade, men ikke dybe forbrændinger. Metoden til at belægge såroverfladen med dyrkede fibroblaster er fundamentalt forskellig, idet hovedkomponenten af den dyrkede cellepulje ikke er keratinocytter, men fibroblaster.

En forudsætning for udviklingen af fremgangsmåden tjente som bevis for, at pericytter, der omgiver de små blodkar er pro genitornymi mesenchymalceller stand til at omdanne i fibroblaster, som producerer mange vækstfaktorer og tilvejebringer sårheling grund af den stærke stimulerende virkning på proliferation og adhæsion af keratinocytter. Anvendelse af dyrkede fibroblaster til lukning såroverflader straks identificeret en række væsentlige fordele ved denne metode i forhold til anvendelsen af dyrkede keratinocytter. Navnlig er fremstillingen af fibroblaster i kultur ikke kræver anvendelse af særlige dyrkningsmedier og vækstfremmere, hvilket reducerer omkostningerne til transplantation mere end 10 gange prisen for at opnå keratinocytter. Fibroblaster let underkastes passage, hvor de delvist mister deres overflade histokompatibilitetsantigener, hvilket igen gør det muligt at anvende til fremstilling af allogene transplantater af celler og skabe deres banker. Forkorter modtager transplantater, klar til anvendelse i en klinik, fra 3 uger (keratinocytter) 1-2 dage (for fibroblaster). Primære kulturer af fibroblaster kan opnås ved dyrkning af celler fra hudfragmenter taget på autodermoplasty og cellepodning tæthed på modtagelse subkulturer af humane fibroblaster er kun 20 × 10 ³ pr 1 cm ².

At undersøge virkningen af fibroblaster og deres regulerende proteiner i proliferation og differentiering af keratinocytter, en komparativ analyse af kendetegnene og morfologien af keratinocytproliferation på substrater af collagen type I og III og fibronektin i co-kultur med humane fibroblaster. Humane keratinocytter blev isoleret fra fragmenter af huden hos patienter med forbrændinger taget under driften af autodermoplastik. Tætheden af keratinocytter var 50 x 103 celler pr cm2. Den kliniske effekt af transplantation af dyrkede fibroblaster blev vurderet hos 517 patienter. Alle patienter blev opdelt i to grupper: 1 - voksne ramt af forbrændinger IIA, B - IV grad; 2. - børn med dybe forbrændinger af IIIB - IV grad. Vurdering af dynamikken i strukturelle og funktionelle organisation af monolagskultur af fibroblaster med hensyn til den rolle i regenereringsprocessen af glycosaminoglycaner, fibronectin, collagen, og tilladt forfatterne til at bestemme den tredje dag som de mest gunstige betingelser for anvendelse af fibroblastkulturer til fremstilling af transplantationer. Undersøgelse af indvirkning på fibroblast proliferation og differentiering af keratinocytter viste, at under in vitro fibroblaster have en udtalt stimulerende virkning, primært på keratinocytceller adhæsionsprocesser, at øge antallet af adhærerende celler og hastigheden for fastsættelse mere end 2 gange. Stimulering af adhæsionsprocesser ledsages af en forøgelse af intensiteten af DNA-syntese og niveauet for proliferation af keratinocytter. Det blev endvidere fundet, at tilstedeværelsen af fibroblaster og ekstracellulær matrix dannet af dem er en forudsætning for dannelsen tonofibrillyarnogo apparat keratinocyt intercellulære forbindelser og i sidste ende til keratinocytdifferentiering og dannelse basalmembran. I behandlingen af børn med dybe brandsår opnået klinisk effekt af transplantation allofibroblastov kultur, især hos patienter med omfattende læsioner af huden donorsteder i et underskud. Kompleks morfofunktcionalnoe undersøgelse viste, at graft kendetegnet fibroblaster aktiv DNA-syntese, samt kollagen, fibronectin og glycosaminoglycaner, som genereres i cellerne i den ekstracellulære matrix. Forfatterne foreslår en høj procentdel af inkorporering af transplanterede fibroblaster (til 96%), en kraftig reduktion i forhold til deres fremstilling (inden for 2-3 timer i stedet for 24-48 uger i tilfælde af keratinocytter), en væsentlig fremskyndelse af helingen af det brænde overflade, og en betydelig reduktion i prisen (i 10 gange) af teknologien til dyrkning af transplantatet fra fibroblaster i sammenligning med keratinocyttransplantation. Brugen af transplantation af dyrkede allofibroblastov gør det muligt at redde børns liv med kritiske forbrændinger - termisk skade mere end 50% af kroppens overflade, der tidligere blev anset for uforenelig med liv. Det er bemærkelsesværdigt, at allogen transplantation af embryonale fibroblaster også overbevisende vist sig ikke kun hurtigere regenerering af sår og rekonvalescens patienter med forskellige grad brænde og areal, men også en betydelig reduktion af dødeligheden.

Autologe fibroblaster anvendes i sådan en kompliceret og plastikkirurgi som en erstatning korrektion skader stemmebåndene. Sædvanligvis anvendes til dette formål bovint kollagen, virkningsvarighed som er begrænset af dets immunogenicitet. At være et fremmed protein, kollagen, kollagenase følsom over for modtageren og kan forårsage immunreaktioner, for at mindske den risiko, som den teknologi, kollagen forberedelser er udviklet, tværbundet med glutaraldehyd. Deres fordel er større stabilitet og lavere immunogenicitet, hvilket har fundet praktisk anvendelse i fjernelse af defekter og vokal snor atrofi. Autologe collagen injektioner blev første gang brugt i 1995. Fremgangsmåder billede bevarelse af den primære struktur af autologe kollagenfibre, herunder enzymatisk katalyserede intramolekylære tværbindinger. Den omstændighed, at naturlige collagenfibre er mere resistente over for nedbrydning af proteaser end rekonstituerede collagentelopeptider hvor cut. Integritet telopeptider vigtigt for kvaternære struktur af kollagenfibrene og tværbindingen mellem tilstødende kollagenmolekyler. Modsætning præparater af bovint kollagen, er autologe collagen ikke forårsager immunreaktioner i recipienten, men det er ikke tilstrækkeligt effektiv som fylder agent. Vedvarende korrektion kan opnås på grund af den lokale produktion af autolog transplantation af collagen ved fibroblaster. Men den undersøgelse af effektiviteten af transplantation af autologe fibroblaster i klinik afslørede nogle vanskeligheder. I den tidlige periode efter transplantation fibroblast kliniske virkning var svagere sammenlignet med den efter indgivelse af bovint kollagen. Når dyrkede autologe fibroblaster ikke kan udelukke muligheden for transformationen af normale fibroblaster i unormal, de såkaldte myofibroblaster, der er ansvarlige for udviklingen af fibrose og ardannelse, hvilket fremgår af reduktionen i kollagengel, på grund af den specifikke interaktion af fibroblaster og collagenfibriler. Endvidere efter seriepassage fibroblasterne in vitro mister deres evne til at syntetisere ekstracellulære matrixproteiner.

Men i øjeblikket eksperimentel teknik perfektioneret dyrkning af humane autologe fibroblaster, som eliminerer de ovennævnte ulemper og fører til onkogen transformation af normale fibroblaster. Autologe fibroblaster opnået ved denne metode anvendes til at udfylde defekterne i blødt væv i ansigtet. I en undersøgelse af H. Keller og medforfattere (2000) modtog 20 patienter i alderen 37 til 61 år med rynker og atrofiske ar behandling. Hudbiopsier (4 mm) BTE region vi transporteres til laboratoriet i sterile rør indeholdende 10 ml dyrkningsmedium (Dulbecco antibiotisk mikoseptikom, pyruvat og kalvefosterserum). Materialet blev anbragt i 3-5 kultivarer med en diameter på 60 mm og inkuberet i en termostat med en atmosfære indeholdende 5% C02. Efter 1 uge blev cellerne fjernet fra opvasken ved trypsinisering og anbragt i 25 cm2 hætteglas. Celler indgives til patienter i en mængde på 4 x 107. Den betydelige og langvarig klinisk effekt blev observeret hos patienter med korrektion nasolabiale folder, og hos patienter med ar efter 7 og 12 måneder efter den tredje transplantation af autologe fibroblaster. Ifølge flowcytometri producerede dyrkede fibroblaster en stor mængde af type I-kollagen. In vitro studier er den normale kontraktilitet af injicerbare fibroblaster vist. To måneder efter subkutan administration af dyrkede fibroblaster i en dosis på 4 x 107 celler blev ikke nøgenmus detekteret. Injicerbare fibroblaster forårsagede ikke ardannelse og diffus fibrose hos patienter. Ifølge forfatteren er de implanterede autologe fibroblaster i stand til konstant at fremstille kollagen, som vil give kosmetisk foryngelsesvirkning. I dette tilfælde er fibroblaster taget fra en ung patient mere effektive end levetiden for differentierede celler, end de opnås hos ældre. I fremtiden er det antaget, muligheden for nedfrysning af dyrkede fibroblaster taget fra unge donor, der skal transplanteres senere en ældre patient af hans egne unge celler. Afslutningsvis er det ikke helt korrekt konklusion, at autologe fibroblaster, forudsat at deres funktionelle sikkerhed er ideelle til korrektion af ansigtets bløddele defekter. I dette tilfælde forfatteren selv påpeger, at i løbet af undersøgelsen dukket op, og nogle problematiske situationer i forbindelse med brug af autologe fibroblast kollagen-system. Den kliniske effekt var ofte svagere end ved brug af kvægkollagen, hvilket forårsagede skuffelse hos patienter.

Generelt ser litteraturdataene om udsigten til klinisk brug af mesenkymale stamceller sig ret optimistisk ud. Forsøg gøres for at anvende autologe knoglemarv-multipotente mesenchymale stamceller til behandling af degenerative fælles læsioner. De første kliniske forsøg med dyrkede mesenkymale stamceller i behandlingen af komplekse knoglebrud udføres. Autologe og allogene mesenchymale stromale knoglemarvsceller anvendes til at generere bruskvæv til transplantation i korrektion af artikulære bruskdefekter grundet traume, eller autoimmune læsioner. Praktiserede fremgangsmåder til klinisk anvendelse af multipotente mesenchymale progenitorceller for at korrigere knogledefekter hos børn med svær osteogenesis fremskridt forårsaget af mutationer af type I collagen-gen. Efter mieloabelyatsii børn-modtagere af transplanteret knoglemarv fra HLA-kompatible rask donor som ufraktioneret knoglemarv kan indeholde en tilstrækkelig mængde af mesenkymale stamceller til at genopbygge alvorlig knogledefekt. Efter transplantation af allogent knoglemarv havde sådanne børn positive histologiske ændringer i trabekulære knogler, en stigning i væksthastigheden og et fald i forekomsten af knoglefrakturer. I nogle tilfælde opnås et positivt klinisk resultat ved transplantation af nært beslægtet allogent knoglemarv og osteoblaster. Til behandling af medfødt skrøbelighed på knogler på grund af ubalance mellem osteoblaster og osteoklaster i knoglevæv anvendes MSK-transplantation også. Restaurering af knogledannelse i dette tilfælde opnås på grund af chimerisering af puljen af stamme og stamcellerstromalceller i patientens knoglevæv.

Metoderne til genetisk modifikation af donor-mesenkymale stamceller forbedres for at korrigere genetiske defekter af stromale væv. Det antages, at mesenchymale progenitorceller snart vil blive anvendt i neurologi til retningsbestemt kimæriseringsprocedurer hjerneceller og skabe en pulje af raske celler, der kan generere mangelfuld enzym eller faktor er ansvarlig for de kliniske manifestationer af sygdommen. Transplantation af mesenchymale stamceller kan bruges til at genoprette knoglemarvsstroma hos kræftpatienter efter radio og kemoterapi og i kombination med knoglemarvsceller - for at genoprette hæmopoiesis. Udvikling af substitutionsbehandling formål at fjerne manglerne i bevægeapparatet anvendelse MSC'er fremme engineering i design matrixbiomaterialer eller biomimics danner skeletter lever efterkommerne af mesenkymale stamceller.

Kilder til mesenkymale stamceller

Den vigtigste kilde til mesenkymale stamceller er knoglemarvsceller hæmatopoietisk stamceller, som i pattedyr konstant differentierer til blodlegemer og immunsystemet, hvorimod mesenkymale stamceller præsenterede små populationer af fibroblastlignende knoglemarvsstromaceller og hjælper med at bevare den udifferentierede tilstand af de hæmatopoietiske stamceller. Under visse betingelser, mesenchymale stamceller differentierer til celler af brusk og knogle. Når udpladet på et dyrkningsmedium i lav densitet plantning mononukleær knoglemarv stromale celler danner kolonier af vedhæftende celler, som i virkeligheden er fibroblast multipotente mesenchymale precursorceller. Nogle forfattere har foreslået, at knoglemarv deponeret uudnyttede mesenchymstamceller, som takket være evnen til at forny sig selv og høj differentiering potentiale, tilvejebringer alle væv i kroppen forgængere mesenkymale stromale celler hele livet mammal organisme.

I knoglemarv udgør stromalcelleelementer et netværk, der fylder rummet mellem sinusoider og knoglevæv. Indholdet af sovende MSC i knoglemarv hos en voksen er sammenlignelig med antallet af hæmatopoietiske stamceller og overstiger ikke 0,01-0,001%. Mesenkymale stamceller isoleret fra knoglemarv og ikke underkastet dyrkning er blottet for klæbemolekyler. Sådanne MSC'er udtrykker ikke CD34, ICAM, VCAM, type I og III kollagen, CD44 og CD29. Derfor in vitro mesenkymale stamceller er ikke fast på kultursubstratet, og mere avancerede progenitor afledte mesenchymstamceller, har dannet cytoskeletale komponenter og receptor apparat celleadhæsionsmolekyler. Stromale celler med fænotypen CD34 findes selv i perifert blod, selv om de er meget mindre i knoglemarv end CD34-positive mononukleære celler. CD34-cellerne isoleret fra blodet og overført til kulturen binder til substratet og danner kolonier af fibroblastlignende celler.

Det er kendt, at i den embryonale periode stammer basen af alle organer og væv hos pattedyr og mennesker stammer fra en fælles pool af mesenkymale stamceller før og på stadiet af organogenese. Derfor antages det, at i en moden krop bør de fleste mesenkymale stamceller være i bindevæv og knoglevæv. Det er blevet fastslået, at størstedelen af cellulære elementer af stroma af løs bindende og knoglevæv er repræsenteret af engagerede stamceller, som dog bevarer evnen til at proliferere og danne kloner in vitro. Med indførelsen af sådanne celler i den totale blodgennemstrømning implanteres mere end 20% af de mesenkymale forfaldsceller blandt de stromale elementer af det hæmatopoietiske væv og de parenkymale organer.

En potentiel kilde til mesenkymale stamceller er fedtvæv, blandt hvilke af engagerede stamceller findes i varierende grader af adipocyt progenitorer. Mindst modne progenitor elementer af fedtvæv - stromale-kar-celler, som er den samme som multipotente mesenchymale progenitorer i knoglemarven kan differentiere til adipocyter under virkningen af glucocorticoider, insulin-lignende vækstfaktor og insulin. I kulturen i stromale vaskulære celler differentierer til adipocyter og chondrocytter og fedtvæv knoglemarvafledte celler danner adipocyter og osteoblaster.

I musklerne blev også stromale stamkilder fundet. I den primære kultur af celler isoleret fra humane skeletmuskler detekteres celler af stellatform og multinukleinerede myotuber. I nærvær af hesteserum stjerneformige celler prolifererer in vitro uden tegn på cytodifferentiation og efter tilsætningen af dexamethason til dyrkningsmediet af differentiering er karakteriseret ved fremkomsten af celleelementer celler med fænotypen af skelet- og glat muskel, knogle, brusk, og fedtvæv. Følgelig er både engagerede og ukomplicerede multipotente mesenkymale progenitorceller til stede i det menneskelige muskelvæv. Det er vist, at en population af progenitorceller til stede i skeletmuskel kommer fra uudnyttede multipotente knoglemarvsceller mesenchymale progenitorceller, og adskiller sig fra myogene satellitceller.

I myokardiet af nyfødte rotter fandt også adhæsive stjerneformige celler, egnede til differentiering potentiale multipotente mesenchymale progenitorceller, som under indflydelse af dexamethason de differentiere til adipocytter, osteoblaster, chondrocytter, glatte muskelceller, myotuber af skeletmuskel og hjertemyocytter. Det er blevet vist, at vaskulære glatte muskelceller (pericytter) udledes multipotente udifferentierede perivaskulær mesenchymale precursorceller. I kulturen i perivaskulære mesenkymale stamceller udtrykker et-glatmuskelactin og blodpladeafledt vækstfaktorreceptor og er i stand til at differentiere i det mindste glatte muskelceller.

Et særligt sted, hvad angår stamreserver, er det bruskvæv, hvis ekstremt lave reparative potentiale menes at skyldes mangel på multipotente mesenkymale stamceller eller differentiering og vækstfaktorer. Det antages, at de multipotente mesenchymale progenitorceller forudindgivet til chondro- og osteogenese indtræder i det bruskvæv fra andre vævskilder.

Vævs oprindelse og betingelser for udførelse af mesenchymale stamceller i sener er heller ikke etableret. Ekspermentalnye iagttagelser antyder, at i tidlige postnatale kanin akillessene celler i primære kulturer i den første passage og fastholde ekspression af collagen type I og decorin, men efter yderligere dyrkning de mister tenotsitov differentieringsmarkører.

Det skal bemærkes, at svaret på spørgsmålet, om faktisk lokaliseret i forskellige væv af multipotente mesenchymale progenitorceller er altid til stede i deres stroma eller væv pulje af mesenchymstamceller kompenseres ved migration af stromale stamceller fra knoglemarv, er det stadig afventes.

Ud over knoglemarv og andre mesenkymvæv zoner af en voksen organisme, kan en anden kilde til MSC være ledningsblod. Det er blevet vist, at navlestrengen vene blod indeholder celler, der har lignende morfologiske og antigene karakteristika med multipotente mesenchymale progenitorceller er i stand til adhæsion og ikke ringere multipotente mesenchymale progenitorceller af knoglemarv oprindelse ved at differentiere potentiale. I kulturer af mesenkymale stamceller af navlestrengsblod detekteret fra 5 til 10% uudnyttede multipotente mesenchymale stamceller. Det viste sig, at deres antal i navlestrengsblod er omvendt proportional med gestationsalder, som er indirekte bevis for migrationen af multipotente mesenchymale progenitorceller i forskellige væv under fosterudviklingen. Der var første information om klinisk anvendelse af de mesenkymale stamceller isoleret fra navlestrengsblod, samt embryonale afledt biomateriale, som er baseret på den kendte evne af føtale stamceller integrere og funktion prizhivlyatsya med organer og vævssystemer voksne modtagere.

Søgningen efter nye kilder til mesenkymale stamceller

Anvendelsen af mesenkymale stamceller af embryonisk oprindelse, som andre føtale celler, skaber en række etiske, juridiske, juridiske og lovgivningsmæssige problemer. Derfor fortsætter søgningen efter ekstraembryonisk cellulært donormateriale. Det mislykkedes klinisk anvendelse af humane hudfibroblaster blev det bestemt ved ikke kun den høje økonomiske formåen af teknologi, men også hurtig differentiering af fibrocytter i fibroblaster med betydeligt mindre potentiale proliferation og producerer et begrænset antal vækstfaktorer. Yderligere fremskridt med at studere biologi af MSK og multipotente mesenchymale knoglemarvsprecursorer tillod udviklingen af en strategi for klinisk anvendelse af autologe mesenkymale stamceller. Teknologien for deres isolering, dyrkning, ex vivo-reproduktion og rettet differentiering krævede først og fremmest undersøgelsen af MSC'ers molekylære markørspektrum. Deres analyse viste, at i de primære kulturer af humant knoglevæv er der flere typer af multipotente mesenchymale stamceller. Pro-osteoblastfænotypen blev fundet i celler, som udtrykker en markør for stromale precursorceller STRO-1, men ikke bærer en osteoblastmarkør-alkalisk phosphatase. Sådanne celler er karakteriseret ved en lav evne til at danne en mineraliseret knoglematrix, såvel som fraværet af ekspression af osteopontin og parathyroidhormonreceptoren. Derivater af STRO-1-positive celler, som ikke udtrykker alkalisk phosphatase, er repræsenteret af mellemliggende og fuldstændigt differentierede osteoblaster. Det er fastslået, at de cellulære elementer af klonede linjer af STRO-1-positive celler af humane trabekulære knogler er i stand til at differentiere i modne osteocytter og adipocytter. Retningen differentiering af disse celler afhænger af eksponering af polyumættede fedtsyrer, proinflammatoriske cytokiner - IL-1b og tumornekrosefaktor-a (TNF-a), såvel som anti-inflammatoriske og immunsuppressive TGF-b.

Senere blev det fundet, at multipotente mesenchymale precursorceller mangler kun specifikke for dem iboende fænotype, men udtrykker komplekse markører, som er karakteristiske for mesenchymal, endotel- epitelceller og muskelceller i fravær af ekspression af hæmatopoietisk celle immunfænotypiske antigener - CD45, CD34 og CD14. Desuden mesenkymale stamceller og konstitutivt inducerbart producere hæmatopoietiske og ikke-hæmatopoietiske vækstfaktorer, interleukiner, og chemokiner, og i multipotente mesenchymale precursorceller udtrykte receptorer for nogle vækstfaktorer og cytokiner. Blandt stromalceller grundlæggende i det menneskelige legeme fandt dormantnye eller hvilende celler med immunfænotype, næsten identisk med den antigene profil af rå 5-fluorouracil multipotente mesenchymale progenitorceller - disse og andre celler udtrykker CD117, mærkning "voksen" stamceller.

Således er en celle markør, der er unik for mesenkymale stamceller, endnu ikke blevet etableret. Det antages, at hvilende celler er uudnyttede populationer af multipotente mesenchymale precursorceller da de ikke udtrykker cellemarkører af garanteret til osteoarthritis (CBFA-1) eller adipogenese (PPAR-y-2). Den langvarige eksponering af langsomt prolifererende hvileceller til føtalt kalveserum fører til dannelsen af terminalt differentierede precursorer, der er kendetegnet ved hurtig vækst. Den klonale vækst af sådanne stamme-mesenchymale celler understøttes af FGF2. Det fremgår, at genom-afledte stromale stamceller "lukket" stram nok er blevet rapporteret om fraværet af spontan differentiering i MSC -. Uden særlige betingelser for at begå endnu er de ikke konverteres i celler af mesenkymale serien.

For at undersøge populationsstrukturen afledte mesenkymale stamceller gennemsøges differentiering markørproteiner på stromacellelinier og primære kulturer. I klonale koloni assay Knoglemarvsceller in vitro vist sig, at når den udsættes for primære kulturer af EGF forøger den gennemsnitlige størrelse af kolonierne og reducerer klonal ekspression af alkalisk phosphatase, mens tilsætningen af hydrocortison aktiverer ekspression af alkalisk phosphatase, som er en markør for osteogen differentiering af MSC'er orientering. Monoklonale antistoffer mod STRO-1 gjorde det muligt at separere og studiepopulationer af STRO-1-positive adhærente celler i et heterogent system Dexter kulturer. Spektret af cytokiner regulere ikke alene proliferation og differentiering af hæmatopoietiske og lymfoide celler, men deltager også i dannelsen er dannelsen og resorption af knoglevæv ved para-, auto- og endokrine mekanismer. Receptor-medieret frigivelse af sekundære messengers, såsom cAMP, diacylglycerol, inositol triphosphat, og Ca2 + anvendes også til markør-analyse af forskellige kategorier af stromale væv af celler, der udtrykker de relevante receptorer. Anvendelse af monoklonale antistoffer som markører lov til at etablere stromal lymfoide organer tilhører retikulære celler for T og B-afhængige zoner.

I nogen tid fortsatte videnskabelige konflikter om spørgsmålet om muligheden for MSC's oprindelse fra den hæmatopoietiske stamcelle. Faktisk, når eksplantation suspension af knoglemarvsceller i monolagskultur i hvilken diskrete kolonier vokser fibroblaster. Det er imidlertid blevet vist, at tilstedeværelsen af forstadier af fibroblast kolonier og forskellige bakterier differentiering af hæmatopoietisk væv som en del af knoglemarven er ikke bevis for deres fælles oprindelse af hæmatopoietiske stamceller. Anvendelse diskriminant analyse af knoglemarvsstamceller fundet, at mikromiljøet ved heterotopisk transplantation, er hæmatopoietiske celler i knoglemarven overført, hvilket beviser eksistensen, i knoglemarven uafhængigt af histogenetic MSC population af hæmatopoietiske celler.

Desuden selektiv kloning metode afsløret i monolagskulturer af knoglemarvsstromalceller af en ny kategori af precursorceller at bestemme deres numre, for at studere deres egenskaber, proliferative og differentiering potentiale. Det konstateredes, at in vitro fibroblastlignende stromaceller prolifererer og danner diploide kolonier, når revers transplantation i kroppen sikrer dannelsen af nye bloddannende organer. Resultaterne af undersøgelser af individuelle kloner indikerer, at der er en population af celler i deres proliferative og differentieringspotentiale stand krav rolle stamcellerne ifølge stromalvævet, Gistogeneticheskaja uafhængig af hæmatopoietiske stamceller i stromale stamceller. Celler af denne population er karakteriseret ved selvbærende vækst og differentierer til progenitorceller af knogle-, brusk- og retikulært knoglemarvvæv.

Af stor interesse er resultaterne af undersøgelser Chailakhyan R. Et al (1997-2001), som var dyrket knoglemarvsafledte stromale progenitorceller kaniner, marsvin og mus af en-MEM dyrkningsmedium suppleret med føtalt kalveserum. Forfatterne udførte eksplanteringen med en initialtæthed på 2-4 x 103 knoglemarvsceller pr. 1 cm2. Som anvendt feeder homolog eller heterolog inaktiveret ved bestråling af knoglemarvsceller i en dosis feeder holdevirkning, men helt blokeret proliferation. To uger primære diskrete kolonier af fibroblaster blev trypsiniseret til fremstilling af monoklonale stammer. Evidence klonoprindelse kolonier blev opnået under anvendelse af kromosomale markører i blandede kulturer af knoglemarv af mandlige og kvindelige marsvin, tidsforskudt optagelse levende kulturer, såvel som i blandede kulturer af knoglemarv af syngene mus og CBA SVAT6T6. Transplantation opslæmning af frisk isolerede knoglemarvsceller dyrket in vitro eller stromale fibroblaster under nyrekapslen blev gennemført i ivalonovyh porøse stilladser eller gelatine såvel som inaktiveret kanin spongiosa matrix. Transplant kloner ind i knoglen dæksel lår marsvin renset fra blødt væv og periosteum, skæres epifysen og grundig vask deres knoglemarv. Benet blev skåret i fragmenter (3-5 mm), tørret og bestrålet i en dosis på 60 Gy. I de benede dæk blev individuelle fibroblastkolonier anbragt og implanteret intramuskulært. Til intraperitoneal transplantation af de stromale fibroblaster, dyrket in vitro, vi anvendte typer A diffusionskammer (V = 0,015 cm3, h = 0, l mm) og D (V = 0,15 cm3, h = 2 mm).

Når studere dynamikken i væksten af klonale stammer Chailakhyan R. Et al (2001) fandt, at de individuelle celler, kolonidannende fibroblaster, såvel som deres efterkommere har stor proliferativt potentiale. Ved den 10. Passage var antallet af fibroblaster i nogle stammer 1,2-7,2 x 10 ⁹ celler. I processen med deres udvikling udførte de op til 31-34 cellulære duplikationer. Således heterotopisk transplantation af knoglemarvafledte stammer dannet ved stromale forstadier flere dusin kloner førte til overførsel af knoglemarvens mikromiljø og uddannelse i den nye zone hæmatopoietisk organtransplantation. Forfatterne har rejst spørgsmålet om, hvorvidt individuelle kloner kan tåle knoglemarvsmikromiljøet stromale celler, eller det kræver samarbejde fra flere forskellige klonogen stromal progenitor? Og hvis de enkelte kloner vil være i stand til at overføre mikromiljø, hvad enten den er fuld af alle tre kim blod, eller forskellige kloner giver dannelsen af hæmatopoietisk mikromiljø for forskellige bakterier? For at løse disse problemer er der udviklet teknologi til dyrkning stromale stamceller i kollagen gel, der giver dig mulighed for at skyde fra overfladen af fibroblaster dyrkede kolonier til efterfølgende heterotop transplantation. Individuelle kloner stromale fibroblaster, knoglemarvsceller dyrket fra CBA-mus og marsvin, skåret sammen med et fragment af gelcoat og transplanteres heterotopisk - under nyrekapslen af syngene mus eller autologe muskelbugen marsvin. Ved transplantation i musklen blev kolonierne på gelen anbragt i knoglerne.

Vi har fundet, at ved 50-90 dage efter transplantation af knoglemarv fibroblast koloni i 20% af observeret i udviklingen transplantation område af knogle eller knogle og hæmatopoietisk væv tilfælde. I 5% af recipientdyr dannede lommer af knogle med et hulrum fyldt med knoglemarv. Inde bone cylindre sådanne foci har en afrundet form og en kapsel fremstillet af knoglevæv, med osteocytter og veludviklet osteoblastisk lag. Knoglemarvskaviteten indeholder retikulære stof med myeloide og erythroide celler, de proportioner, som ikke afviger fra den i normal knoglemarv. Den nyregraft var en typisk medullær legeme dannet af nativt knoglemarvstransplantation, hvor knogle kapsel dækker kun benpiben fra nyrekapslen. Hæmatopoietisk væv inkluderet myeloid, megakaryocytiske og erythroide elementer. Stroma af marvkanalen blev bihuler veludviklet og indeholdt typisk fedt cellesystemet. På samme tid i området af transplantation af nogle kolonier knogle med ingen tegn på hematopoiese det blev fundet under nyre kapsel. Undersøgelse af proliferativ og differentiering styrken af individuelle kloner blev fortsat på monoklonale kanin knoglemarvsceller stammer, cellerne resuspenderes i dyrkningsmedium og i et separat ivalonovoy svamp veje 1-2 mg gemt under nyrekapslen af kanin knoglemarv donor. Sådanne celler blev underkastet autotransplantation 21 monoklonalt stamme. Resultaterne blev taget i betragtning om 2-3 måneder. Forfatterne fandt, at 14% af de transplanterede knoglemarv monoklonale stammer formede legeme sammensat af knogle og knoglemarv hulrum fyldt med hæmatopoietiske celler. I 33% af tilfældene transplanterede stammer dannede kompakt knogle med forskellige størrelse hulrum ostootsitami murede i osteoblastisk og udviklede lag. I nogle tilfælde, svampe transplanterede kloner udviklet reticulum uden ben eller hæmatopoietiske celler. Undertiden forekom retikulære stromadannelse med et veludviklet netværk af sinuskurver, men ikke befolket de hæmatopoietiske celler. Således opnåede resultater svarede til dem, der opnås ved transplantation af kloner på kollagengel. Men hvis kloner transplantation dyrket på substratet resulterede i dannelsen af marv væv er 5% af knoglen - 15%, og retikulære stof - i 80% af tilfældene, transplantation monoklonale stammerne dannelse af knoglemarvsceller blev observeret i 14% af tilfældene af knogle - i 53% og retikulære - i 53% af tilfældene. Ifølge forfatterne, indikerer dette, at betingelserne for gennemførelse af proliferative og differentieringsfaktorer potentialer stromale fibroblaster når transplanteret på porøse stilladser var mere optimal end med deres transplantater i ben og dækker kollagensubstratet. Det er ikke udelukket, at brugen af mere avancerede metoder til dyrkning og transplantation af kloner tilbagemeldinger kan forbedre betingelserne for gennemførelsen af dens kloner differentiering potentialer og ændre disse relationer. Ene eller anden måde, men den vigtigste værdi af forskningen ligger i det faktum, at nogle af klonerne stromaceller stand til at danne knoglevæv samtidig sikre stromale hæmatopoietisk mikromiljø straks for tre spirer af knoglemarv blod: erythroide, myeloide og megakaryocytisk, at skabe en stor nok fodfæste hæmatopoietisk væv og nogle knoglemasse.

Yderligere løste forfatterne problemet med evnen til disse typer celledifferentiering af individuelle klonale stromal stamceller under betingelser i et lukket system af diffusionskamre. Desuden var det nødvendigt at bestemme, om individuelle kloner af pluripotente udstille eller display til differentiering potentiale kræver den kooperative interaktion adskillige kloner med et fast skilt cytodifferentiation, forskelligt forhold mellem som bestemmer foretrukne dannelse af knogle, brusk eller netformet. Ved at kombinere to metodiske tilgange - monoklonalt isolater knoglemarvs stromale progenitorceller og transplantation dem ind i diffusionskamre, Chailakhyan R. Et al (2001) opnåede resultater, der er tilladt at nærme forståelsen af den strukturelle organisering af knoglemarvsstroma. Transplantationssystemerne monoklonale stammer stromale progenitorceller til typen O celler resulterede i dannelsen af både knogle og bruskvæv, hvilket viser evnen hos afkom af en kolonidannende stromaceller samtidigt danner knogle og brusk. Forudsætningen om, at knogle- og bruskvæv stammer fra den fælles stromal-progenitorcelle, er gentagne gange blevet udtrykt. Denne hypotese havde imidlertid ikke en korrekt eksperimentel bekræftelse. Dannelsen af knogler og brusk i diffusionskamre var et nødvendigt bevis for eksistensen blandt stamceller i knoglemarvsstroma af en fælles precursorcelle for disse to typer væv.

Derefter 29 klonale stammer anden og tredje passage, primære kulturer afledt fra knoglemarven af kaninen blev anbragt i diffusionskamre og implanteres intraperitonealt homolog dyr. Undersøgelser har vist, at 45% af monoklonale knoglemarvsstammer har osteogene potenser. Undtagelsesvis indeholdt retikulært væv 9 kamre, men sammen med knogle og bruskvæv var det til stede i 13 flere kamre, hvilket tegnede sig for 76% af alle stammer. I kamre af type O, hvor differentiering var mulig for både knogle- og bruskvæv, blev 16 stammer undersøgt. I fire kamre (25%) blev både knogle- og bruskvæv dannet. Det skal igen bemærkes, at de undersøgelser Chailakhyan R. Et al (2001) individuelle progenitorceller undergik cellestamme bestående af fra 31 til 34 fordoblinger, og deres afkom var 0,9-2,0 x 10 ⁹ celler. Antallet af mitoser, hvortil prækursorcellerne fra de polyklonale stammer blev udsat, var praktisk talt det samme som for cellerne i de monoklonale stammer. Således hastigheden for udvikling af polyklonale stammer, især i den første fase af deres dannelse, i vid udstrækning afhænger af antallet af kolonier, der anvendes til at indlede stammer. Diploide stammer af humane embryonale fibroblaster (WI-38) for 12-15 reklonirovanii th fordobling niveauer også dannet kolonier forskellige diameter og i deres indhold af celler. Store kolonier indeholdende mere end 103 celler var kun 5-10%. Med stigningen i antallet af divisioner faldt procentdelen af store kolonier. Mono- og polyklonale knoglemarv stromale fibroblaststammer bevaret en diploid kromosom indstillet efter 20 eller flere fordoblinger, og tendens til udvikling var sammenlignelig med dynamikken i diploide stammer embryonale fibroblaster. Analyse af differentiering potentiale af specifikke knoglemarvs stromale progenitorceller, der foretages af transplantationscentre monoklonale stammer i diffusionskamre, viste, at halvdelen af dem osteogene. Store kolonier tegnede sig for 10% af deres samlede antal. Som følge heraf svarede antallet af osteogene kolonidannende celler til ca. 5% af deres samlede population. I den samlede masse af osteogene stamceller, der blev identificeret af forfatterne, var der celler, der var i stand til at danne knogle og bruskvæv samtidigt. For første gang det sig, at for disse to typer væv i den voksne organisme er den fælles precursor celle: 25% af de testede kloner blev skabt ved tilsvarende celler og deres numre i den generelle population af progenitorceller var ikke mindre end 2,5%.

Således har heterotopisk transplantation af individuelle kloner af knoglemarvfibroblaster åbnet nye aspekter af den strukturelle organisering af populationen af mesenkymale stamceller. Fundet stromale stamceller stand til at overføre specifikke mikromiljø straks for alle hæmopoietiske stamceller hvilket nummer blandt de undersøgte kloner større på forskellige modeller er fra 5 til 15% (0,5-1,5% af det samlede antal progenitorceller detekteret). Sammen med klonerne, overføre fuldstændig knoglemarvens mikromiljø, der er progenitorceller, deterministiske kun til knogledannelse, hvilken form, når de overføres til et åbent system, knoglen, der ikke understøtter udviklingen af hæmatopoiese. Deres antal fra det totale antal stamceller er 1,5-3%. Nogle af disse celler kan danne knoglevæv med en begrænset periode med selvvedligeholdelse. Følgelig er populationen af stromal progenitorceller heterogen i dets differentieringspotentiale. Blandt dem er der en celle i kategorien hævder rolle stromastamceller kan differentiere i alle tre dimensioner iboende i knoglemarv stromalvævet, dannende knogle, brusk og retikulære væv. Disse data giver os mulighed for at håbe, at med hjælp af forskellige cellemarkører vil være muligt at bestemme bidraget fra hver type stromale celler i mikromiljø af den specifikke organisation og understøtte hæmatopoiese i Dexter kulturer.

Funktioner af mesenkymale stamceller

I de seneste år, det konstateret, at i stationære kulturer af knoglemarv mesenkymale multipotente progenitorceller præsenteret en begrænset population af små agranular celler (RS-1) -celler, kendetegnet ved lav evne til kolonisering og fravær af Ki-67-antigenekspression specifikt for prolifererende celler. Antigene parametre dormantnyh RS-1-celler er forskellige fra spektret af begået antigener hurtigt proliferende stromale stamceller. Det konstateredes, at en høj grad af proliferation af engagerede progenitorceller blev kun observeret i tilstedeværelsen af RS-1-celler. Til gengæld RS-1-celler forøger vækst under indflydelse af faktorer, der udskilles af de mest modne afledte multipotente mesenchymale progenitorceller. Det ser ud til, at RS-1-celler er en underklasse af ubestemte MSC'er, der er i stand til genbrug. In vitro resistent over for 5-fluorouracil stromale stamceller i knoglemarven kendetegnet ved en lav RNA-indhold og høje niveauer af ekspression af ornithindecarboxylase gen - markør ikke-prolifererende celler.

Intensive avl stromale progenitorceller begynder efter deres fiksering på substratet. Når dette udtrykkes markørprofil af dårligt differentierede celler: SH2 (TGF-receptor (3), SH3 (domæne signalering protein), collagen type I og III, fibronektin, adhæsionsreceptor VCAM-1 (CD106) og ICAM (CD54), cadherin11 , CD44, CD71 (transferrin receptor), CD90, CD120a og CD124, men uden ekspression af karakteristiske markører for hæmatopoietiske stamceller (CD34, CD14, CD45). Klonal vækst muliggør gentagne gange passeret mesenkymale stamceller til fremstilling af en kultur af mange genetisk homogen stromal progenitor pluripotente celler. Cerea 2-3 passage af deres antallet når 50-300 million. I kultur af tilstrækkelig densitet efter standsning af proliferation af stromale stamceller til forskel hæmatopoietiske væv fibroblaster differentiere til adipocytter, myocytter, bruskceller og knoglevæv. Kombinationen af de tre differentiation regulatoriske signaler omfattende 1-methyl-izobutilksantin (inducer af intracellulær cAMP-dannelse), dexamethason (en inhibitor af phospholipase a og C) og indomethacin (en cyclooxygenase-inhibitor, thromboxan-sænkende aktivitet og) vender sig i adipocytter og 95% mesenkymale stamceller. Adipocyt-dannelse fra umodne stromaceller bekræftet ekspression af lipoproteinlipase gen, histokemisk identifikation af apolipoproteiner og peroxysomal receptorer. Celler fra den samme klon påvirket af TGF-b i serumfrit medium skaber en homogen population af chondrocyt. Den flerlagede cellekultur af brusk ekstracellulære matrix er kendetegnet udviklet bestående af proteoglycan og collagen type II. Næringsmediet med 10% føtalt serum virkning differentieringssignaler kompleks består af s-glycerophosphat (donator uorganisk phosphat), ascorbinsyre og dexamethason, i de samme kultur stromale progenitor progenitorceller fører til dannelsen af celleaggregater. I sådanne celler, er der en progressiv stigning i aktiviteten af alkalisk phosphatase og osteopontin niveauer, hvilket indikerer dannelsen af knoglemineralisering hvilke celler bekræftede en progressiv stigning i intracellulært calcium.

Ifølge nogle, evnen af mesenkymale stamceller dele sig uendeligt og reproduktion af forskellige typer af mesenkymale-afstamningsceller kombineret med en høj grad af plasticitet. Når de indgives i ventriklerne, eller hvidt stof mesenchymstamceller vandre ind i parenchyma af nervevævet og differentierer til neuronal eller glial cellelinie. Derudover er der information om MSC transdifferentiering i hæmatopoietiske stamceller både in vitro og in vivo. En mere dybtgående analyse i nogle undersøgelser bestemmes usædvanlig høj duktilitet af MSC'er, der viser sig i deres evne til at differentiere til astrocytter oligodendrocytter, neuroner, cardiomyocytter, glatte muskelceller og skeletmuskelceller. I en række undersøgelser transdifferentsirovochnogo potentiale af MSC'er in vitro og in vivo fundet, at multipotente mesenchymforstadieceller af knoglemarv oprindelse terminalt differentiere til cellelinier, som danner knogle, brusk, muskel, nerve og fedtvæv samt sener og stroma, der understøtter hæmatopoiese .

Men i andre undersøgelser, kunne der ikke påvises nogen tegn på begrænsning pluripotens genom mesenkymale stamceller og stromale progenitorcellepopulationer, men kan kontrollere mulige pluripotente stromale celler blev undersøgt mere end 200 MSC kloner isoleret fra en primær kultur. Langt størstedelen af in vitro-kloner bibeholdt evnen til at differentiere til osteogene, chondrogen og adipogeniske retninger. Når der korrigeres sandsynligheden for migrering af recipientcellerne ved transplantation af mesenchymstamceller under nyrekapslen eller i diffusionskamre det vist sig, at stromale progenitorceller in situ fastholde heterogen fænotype, hvilket indikerer enten fravær af en zone transplantation restriktionsfaktorer eller fraværet af pluripotente MSC'er alene. Samtidig tillod eksistensen af en sjælden form for somatiske pluripotente stamceller, som er fælles forløbere for voksne stamceller.

På flersporede, men ikke sandt pluripotente mesenkymale stamceller udgør en meget lille brøkdel af knoglemarvsceller og er i stand under visse omstændigheder, når de dyrkes in vitro til at proliferere uden at komme i differentiering, som det fremgår af deres inducerede linjeforpligtelse af celler i knogle, brusk, fedt, muskelvæv , såvel som i tenocytter og stromale elementer, der understøtter hæmatopoiesis. Typisk kontinuerlig eksponering i dyrkningsmedium med føtalt kalveserum provokerer output MSC'er i stromale af engagerede progenitorceller, hvis afkom undergår spontan endelige differentiering. In vitro muligt at opnå retningsbestemt osteoblastdannelse ved tilsætning til mediet conditioning dexamethason, ß-glycerophosphat og ascorbinsyre, mens kombinationen af differentiering signalerer dexamethason og insulin inducerer dannelsen af adipocytter.

Fastslået, at før ind i fase af terminal differentiering af knoglemarv-MSC'er til at skabe visse dyrkningsbetingelser indledningsvis differentiere til fibroblastlignende mesenchymstamceller. Derivater af disse celler in vivo er involveret i dannelsen af knogle, brusk, sene, fedt og muskelvæv samt stromale support hæmatopoiese. Mange forfattere forstå udtrykket "multipotente mesenchymale progenitorceller" som faktisk MSC'er, og de kommitterede stromale stamceller og knoglemarv mesenkymvæv. Klonal analyse af mesenkymale multipotente progenitorceller af knoglemarv oprindelse viste, at lidt mere end en tredjedel af klonerne differentierede i osteo-, hondro- og adipocytter, hvorimod andre kloner celler har osteogent potentiale og en form kun hondro- og osteocytter. Denne klon af multipotente mesenchymale precursorceller som IUD-9, under passende betingelser mikromiljø differentierede til celler med en fænotype og funktionelle egenskaber ikke blot osteoblaster, chondrocytter og adic potsitov men stromaceller, der understøtter hæmatopoiesis. Isoleret fra føtale rotte knoglemarvsceller klone RCJ3.1 differentierede mesenchymceller af forskellige fænotyper. Ved den kombinerede virkning af ascorbinsyre, b-glycerophosphat, og dexamethason fra cellulære elementer i denne klon dannes først flerkernede myocytter og derefter successivt, adipocytter, chondrocytter og øer mineraliseret knogle. Populationen af granulære celler fra periosteum af rottefostre svarer til uudnyttede multipotente mesenchymale progenitorceller, som karakteriseret ved en lav grad af proliferation, ikke udtrykker markører for differentiering og differentieres i dyrkningsbetingelser til dannelse hondro-, osteo- og adipocytter og glatte muskelceller.

Således bør det anerkendes, at spørgsmålet om plyuri- eller multipotency genomet af mesenkymale stamceller er stadig åben, hvilket følgelig påvirker præsentationen af differentieringspotentialet af stromale stamceller, som også er ikke helt installeret.

Eksperimentelt bevist og vigtig egenskab ved mesenkymale stamceller er deres evne til at forlade vævet niche og cirkulere i det almindelige kredsløb. For at aktivere det genetiske program for differentiering, skal sådanne cirkulerende stamceller falde ind i det passende mikromiljø. Det vises, at når de indgives systemisk til blodbanen MSC recipientdyrene umodne celler implanteret i forskellige organer og væv, så differentieret i blodceller, myocytter, adipocytter, chondrocytter og fibroblaster. Følgelig De lokale vævsområder forekommer Signal-regulatorisk vekselvirkning af engagerede og uudnyttede stromale stamceller, såvel som mellem dem og de omgivende modne celler. Det antages, at differentieringen induktion udføres parakrine regulatoriske faktorer af mesenchymal oprindelse og nemezenhimalnogo (vækstfaktorer, eicosanoider, ekstracellulære matrixmolekyler), som tilvejebringer de rumlige og tidsmæssige relationer i mikromiljø multipotentielle mesenchymale stamceller. Derfor bør lokal beskadigelse af mesenkymvæv føre til dannelsen af et mikromiljø zoner multipotente mesenchymale precursorceller adskiller sig kvalitativt fra de komplekse regulatoriske signaler intakte væv, i hvilke fysiologiske processer forekommer i stedet for reparerende regenerering. Denne skelnen er af afgørende betydning for ekspertise i cellefænotype i normal og induceret skade på mikromiljøet.

Ifølge ideerne er det her, at mekanismerne i den grundlæggende forskel mellem to kendte processer - fysiologisk regenerering og inflammatorisk proliferation - lægges. De første af dem slutter med genoprettelsen af specialiseret cellulær vævssammensætning og dens funktion, medens resultatet af proliferationsprocessen er dannelsen af modne bindevævselementer og tab af funktion af den beskadigede vævszone. For at udvikle optimale programmer til brug af multipotente mesenkymale stamceller i regenerativ plastik medicin er der således behov for en omhyggelig undersøgelse af egenskaberne ved indvirkningen af mikromiljøfaktorer på differentieringen af MSC'er.

Afhængighed af strukturen af rummet af stamceller på cellulære para- og autokrine regulatorer, hvis ekspression er moduleret af eksterne signaler, tvivler ingen. Blandt regulatoriske faktorer er de vigtigste kontrollen med asymmetrisk opdeling af MSC'er og ekspressionen af gener, der bestemmer kommissionsstadierne og antallet af celledivisioner. Eksterne signaler, som den videre udvikling af MSC afhænger af, er tilvejebragt af deres mikromiljø. I umodne MSC'er til at formere sig i tilstrækkelig lang tid, samtidig med at evnen til at differentiere til adipocyter linje, myofibroblaster, hæmatogen stromavæv, bruskceller, og knogle. Det konstateres, at en begrænset population af cirkulerende SB34-negative stromale celleelementer fra blodomløbet returneres til knoglemarvsstroma væv, omdannes til en linje, hvor CD34-positive hæmatopoietiske stamceller. Disse observationer tyder på, at recirkulation progenitor mesenchymceller i blodstrømmen af væv tilvejebringer støtte for balancen i stromale stamceller i forskellige organer ved at mobilisere fælles pulje af umodne knoglemarvs stromale celler. Differentiering af MSC'er i celler med flere mesenchymale fænotyper og deres deltagelse i reparation eller regenerering af knogle, brusk, sener og fedtvæv in vivo påvist ved adoptive transfer modeller i forsøgsdyr. Ifølge andre forfattere, er fjernt migration af MSC'er vaskulære leje kombineret med en lokal forskydning eller korotkodistantnym multipotente mesenchymforstadieceller i vævet ved reparation brusk, muskel regenerering, og andre reduktionsreaktioner.

Lokale reserver stamceller stromalvævet fundamenter spiller en rolle kilde til celler i en fysiologisk væv regenereringsprocesserne og der genopfyldes af fjerne transport MSC'er som udgifter stromale væv stamceller ressourcer. Imidlertid har behov for omgående mobilisering af cellulær reparative kapacitet, såsom multipel trauma, i de reparative processer i regenerering deltager MSC'er hele toget, og periferien gennem blodbanen rekrutteret mesenchymale precursorceller af knoglemarv.

Transplantation af mesenkymale stamceller

Der er visse paralleller mellem processerne for fysiologisk regenerering af væv og deres dannelse i perioden med intrauterin udvikling. Den embryogenese af mennesker og pattedyr, dannelsen af forskellige typer af specialiserede celler, der stammer fra ecto, meso- og endodermal kim lag pulje, men med den obligatoriske deltagelse af mesenchymet. Det løse mobilnet af embryonisk mesenkymvæv udfører adskillige regulatoriske, metaboliske, skelet- og morfogenetiske funktioner. Bogmærke provisoriske organer kun udføres efter det kondenserende mesenkym på bekostning af vækst klonogene progenitorceller, der genererer primær morfogenetiske signaler organogenese. Stromalderivaterne af det embryonale mesenchym skaber en cellulær ramme for foreløbige organer og danner basis for deres fremtidige energiforsyning ved at dyrke primære blod- og lymfekarre. Med andre ord forekommer stromalelementerne i føtalorganernes mikrocirkulationsenhed før dannelsen af deres strukturelle funktionelle enheder. Derudover tilvejebringer aktiv migration af mesenchymceller under organogenese rumlig orientering udvikle organer som følge mærkning deres grænser efter volumen Restriction homeotiske Hox-tepov. På stromal stillads er der også en samling af strukturelle og funktionelle enheder af parenkymatiske organer, som ofte indeholder morfogenetisk og funktionelt helt forskellige celler. Følgelig i embryogenese mesenkym er primære funktion og gennemføres ved at generere regulatoriske signaler aktiverende regional progenitor proliferation og differentiering af epitelceller. Embryoniske mesenchymceller producerer vækstfaktorer, såsom LEG, HGF-b, CSF, for hvilke parenkymale stamceller har tilsvarende receptorer. I det differentierede modne væv af en voksen organisme frembringer stromalcellenet også signaler for at opretholde levedygtigheden og proliferationen af stamceller fra ikke-mesenkymal oprindelse. Imidlertid spektrum stromale regulatoriske signaler i postnatal ontogenesis anden (SCF, HGF, IL-6, IL-1, IL-8, IL-11, IL-12, IL-14, IL-15, GM-CSF, flt-3, LIF osv.) Og har til formål at tilvejebringe fysiologisk regenerering eller reparation af beskadigede vævszoner. Desuden er spektrale karakteristika for stromal regulatoriske faktorer i hver slags væv og endda inden for samme organ forskellige. Især hæmatopoiese og lymfopoiese til formering og differentiering af hæmatopoietiske og immunkompetente celler forekommer kun i visse organer, inden der virker stromal mikromiljø tilvejebringelse af betingelser for modning af hæmatopoietiske og lymfoide celler. Det er op til regulatoriske faktorer mikromiljø afhænger af evnen af hæmatopoietiske og lymfoide celler til genbefolke kroppen til at formere sig og modnes til dens mikrostrukturelle nicher.

Blandt komponenterne i den ekstracellulære matrix, som producerer multipotente mesenchymforstadieceller, skal det bemærkes, fibronectin, laminin, collagen og proteoglycaner, samt CD44 (hyaluronan og osteopontin receptor) modtager den vigtigste del i tilrettelæggelsen af den intercellulære vekselvirkning og dannelsen af ekstracellulær matrix i knoglemarven og knogle . Det er bevist, at knoglemarv mesenkymale, multipotente celler skabe redshestvenniki stromal mikromiljø, tilvejebringe de induktive og regulatoriske signaler ikke kun MSC, men også hæmatopoietiske prækursorer og nemezenhimalnye stamceller fra knoglemarv. Det er kendt, at MSC'er, der er involveret i hæmatopoiese målt ved deres evne til at differentiere til stromaceller der understøtter hæmatopoiesis, hvor den aktive vejledning MSK signal opnået direkte fra hæmatopoietiske stamceller. Derfor er kulturen i netværket stromale stamceller er grundlaget for fodring af alle kloner af hæmatopoietiske celler.

I en moden organisme intensitet af hæmodialyse og lymfopoiese i en tilstand af dynamisk ligevægt med "udgifter" af modne blodceller og immunsystemceller i periferien. Da knoglemarvsstromalceller og lymfoide organer sjældent opdateret, er betydelige omstruktureringer stromale strukturer ikke forekommer i dem. Bringe systemet med dynamisk ligevægt er muligt ved hjælp af mekanisk beskadigelse af organer hæmo eller lymfopoiese, hvilket fører til den samme type af sekventielle ændringer, der påvirker ikke kun og ikke så meget af hæmatopoietiske eller lymfoide celler, som stromale strukturer beskadiget organ. I processen med reparative regenerering primært dannet stromale ramme, som derefter repopulere hæmatopoietiske eller immunceller. Dette længe kendt faktum gør posttraumatisk regenerering bekvem model til undersøgelse af stromale mikromiljø bloddannende organer. Især til undersøgelse af reparerende regenerering af knoglemarv bruges mekanisk tømning benpibe af lange knogler - curettage, så hurtigt og effektivt at bringe den hæmatopoietiske væv fra en tilstand af dynamisk ligevægt. Når man undersøger processen med reparative regenerering af hæmatopoietiske og stromale knoglemarvsceller komponenter efter mekanisk tømning af rygmarvshule af skinnebenet marsvin fundet, at (koncentrationen og mængden af stromal progenitorceller antallet af hæmatopoietiske celler,) mellem indikatorer regenerering af hæmatopoietiske og stromaceller der er ingen direkte sammenhæng. Desuden blev det konstateret, at stigningen i populationen af stromale stamceller forekommer på et tidligere tidspunkt efter curettage, og selv stromale fibroblaster fosfatazopolozhitelnymi, som er karakteristisk for osteogene væv. Det blev også fastslået, at curettage 3-5 lange knogler fører til vækst af cellepopulationen i knoglemarven og ikke-opererede knogle selv i milten, som i marsvin er kun lymphopoietisk krop.

Morfologiske billede reparative processer i knoglemarv kyuretirovannyh tibial marsvin normalt svarer til litteraturdata opnået i forsøg på dyr af andre arter, dynamikken i ændringer, der finder sted efter fjernelsen af den hæmatopoietiske væv er den samme for alle arter og forskellen kun vedrører de tidsparametre . Morfologisk procedure fase for at genoprette hæmatopoese in marvhulen tømmes i successive processer organiserer blodpropdannelse grove fiber knogle, dens resorption, af sinusoider og retikulære formation stroma, hvilket yderligere repopulariserende hæmatopoietiske elementer. Antallet af hæmatopoietiske stamceller i knoglemarv vævsregeneration proces stigninger i parallel stigning i indholdet af hæmatopoietiske stamceller.

Gerasimov Yu et al (2001) sammenlignede de ændringer i antallet af hæmatopoietiske celler og mængden af stromale celleprecursorer i de enkelte faser af regenereringsprocessen. Det konstateredes, at kvantitative ændringer i knoglemarvsceller i knogle kyuretirovannoy matcher dynamik morfologiske restitution karakteristika. Reduktion i de første tre dage af celleindholdet i regenerere forfattere tilskriver tabet af hæmatopoietiske celler på grund af de negative virkninger af mikromiljøet, hvilket skaber retikulære væv vokser i den resterende knoglemarven i epifysen og i sidstnævnte til dannelse af foci osteoid og vaskulær beskadigelse med udskrabning. 7-12 tyvendedagen hæve yaderosoderzhaschih celler falder sammen med fremkomsten af den enkelte foci i myeloide hæmatopoietiske stromalceller spredning zoner. På den 20. Dag er der betydelige dele af den regenererede knoglemarv og veludviklede bihuler, som ledsages af en betydelig stigning i totalt celleantal. Men antallet af hæmatopoietiske celler i denne periode var 68% af kontrolniveauer. Dette er konsistent med tidligere publicerede data, der viser, at antallet af bloddannende celler efter curettage når standarder kun 35-40 dage efter operationen.

I den tidlige posttraumatiske periode er den primære cellulære kilde til genoprettelse af hæmopoiesis de cellulære elementer bevaret i curettagen. I senere tilfælde er hovedkilden til regenerering af knoglemarvshomatopoetisk væv stamceller, der repopulerer de frie stromalzoner. Med hensyn til visse kategorier af stromale celler (endotel, retikulære og osteogene), kilderne til deres uddannelse i omstruktureringen af den medullære hulrum, er fortsat uklare. Resultaterne af Yu.V. Gerasimova et al (2001) viser, at i den resterende marvknogle efter curettage cellekoncentration på kolonidannende fibroblaster signifikant højere end i normal knoglemarv. Forfatterne mener, at med curettage er mere intens selektiv eluering af hæmatopoietiske celler sammenlignet med stromale kolonidannende celler, der medvirker i dannelsen af stroma og fastere forbindelse med dets basisk stof end hæmatopoietiske celler.

Dynamikken i ændringer i antallet af celler, der danner kolonier fibroblaster korrelerer med intensiteten af osteogenese processer efterfølgende trabekulær knogleresorption og -dannelse retikulære stroma som befolke hæmatopoietiske celler. De fleste af de stromale stamceller udgør et groft fibrøst knoglevæv og en retikulær stroma ved de angivne regenereringstider. For frakturer af lårbensknogle i tilstanden i forlænget osteosyntese på 5. Dag i regenereringszonen øger koncentrationen af celler og antallet af kolonidannende fibroblaster og knogledannelse i intensiv deres antal øges med 6 gange. Det er kendt, at knoglemarvsceller, der danner fibroblastkolonier, har osteogene egenskaber. Antallet af stromal progenitorceller øges før kolonisering af området af den cortexerede knoglemarv ved hæmatopoietiske celler. Dette er i god overensstemmelse med beviser for, at stromaceller tilvejebringer dannelsen af et hæmatopoietisk mikromiljø. Naturligvis, oprettelse af hæmatopoietisk mikromiljø svarer til et vist niveau af regenerering af stromalvævet, og øger antallet af hæmatopoietiske celler ved ekspansion stromal brohoved egnet til hæmatopoiese.

Af største interesse er forfatterens data, at umiddelbart efter curettage stiger antallet af stromal stamceller i skeletets fjerne dele. Begyndende fra den sjette time, og ved den tyvende dag inklusive i den kontralaterale skinneben observeres i mere end to-fold forøgelse af koncentrationer, og antallet af celler danner kolonier af fibroblaster. Mekanismen for dette fænomen er sandsynligvis forbundet med den kendsgerning, at en massiv knoglemarv skade resulterer i dannelsen af et stort antal af blodpropper samtidig ødelægger et betydeligt antal blodplader og frigivelse i blodet blodpladeafledt vækstfaktor (RBSK), som vides at forårsage proliferation af celler danner kolonier fibroblaster placeret i kroppen uden for den proliferative pool. I forsøg med kaniner lokal administration MSC'er fremmer genoprettelse af kirurgisk beskadiget brusk i knæet, som kan være forbundet med dannelsen af chondrocytter afledt af MSC'er indført. Imidlertid reparerende regeneration af knogledefekter i laboratorierotter er signifikant forøget, når der anvendes mesenchymstamceller indesluttet i et keramisk ramme. Derfor kan vi antage, at hvis du ikke RBOK, så enhver anden faktor, der stammer fra de beskadigede stromaceller, har en fjern stimulerende virkning på proliferation af mesenkymale stamceller i intakte områder af knoglemarven og stimulerer deres vandring ind i området af defekten knoglemarvsvæv. Til gengæld denne strid med litteratur data fra tidligere år, hvilket indikerer, at stromale celler er ansvarlige for mikromiljø, i modsætning til hæmatopoietiske celler ikke er i stand til at migrere og komme fra lokale kilder.

Alligevel er resultaterne af undersøgelsen Gerasimov Yu et al (2001) antyder, at anvendelsen af mekanisk traume ikke blot forårsager en skarp omstrukturering af stromalvævet i kyuretirovannoy knogler, men også væsentlige ændringer i stroma fjerntliggende knogler intakt, dvs. Der er en systemisk reaktion stromalvæv til lokal traume. Og når den anvendes polytrauma - multipel curettage - denne reaktion forstærkes og observeres ikke kun i den opererede ben og fjerne dele af skelettet, men også i de lymfoide organer, især milten. Mekanismen for et sådant systemisk respons af knoglemarvsstrømvæv og milt til lokalt traume og polytrauma forbliver ukendt. Det antages, at denne proces er forbundet med virkningen af den humorale faktor frigivet mesenchymal stroma medullær knoglemarvskaviteten. Muligheden for at gøre knoglemarvsstromaceller og milt organonespetsificheskogo humoral faktor ansvarlig for celleproliferation, kolonidannende fibroblaster indikerer data om deres kolonistimulerende aktivitet i monolagskulturer af knoglemarv.

I denne henseende er det værd at bemærke, at når de indgives systemisk multipotente mesenchymforstadieceller repopulariserende deres derivater ikke blot knoglemarv, men også andre væv, som anvendes, især til genterapi. Det er vist, at efter intravenøs indgivelse af store mængder MSC'er med genomet af vild-type mus med mutant -collagengenet I donorceller erstatte op til 30% af cellerne i knogle og brusk væv af modtageren, og de transficerede mesenkymale stamceller mus secernerer IL-3 menneske, til 9 måneder effektiv support hæmatopoiese ved deres samtidige indgivelse med humane hæmatopoietiske stamceller i immundefekte mus.

[5], [6], [7], [8], [9], [10], [11], [12], [13], [14]

Genetisk modifikation af mesenkymale stamceller

Yderligere eksperimentelle succes af den genetiske modifikation skal bemærkes MSC'er transfektion Faktor IX-gen i humane MSC'er efterfulgt af overførsel af celletransfektanter immundefekte mus, som fører til fremkomsten i blodet antihæmofilifaktor B i løbet af 8 uger efter transplantation. I dette eksperiment blev posttranslationel modifikation af faktor IX med y-glutamylcarboxylase udført i transficerede celler. Transduktion af MSC'er med en retroviral vektor kodende for human faktor IX, har været mindre vellykket - efterfølgende indføring af disse celler med hæmofili hund i et terapeutisk niveau af faktor IX, som understøtter normal intensitet koagulering hæmostase, kun i 12 dage.

Transplantationen af mesenkymale stamceller i dyrets hjerneparenchyma har vist, at donor-umodne celler transformeres både i populationen af neuroner og glia. Indpodning neuronale derivater rask donor mesenkymvæv teoretisk muliggør korrektion af genetiske abnormiteter i hjernen i patienter med Gauchers sygdom og andre lidelser i lipidmetabolisme, carbohydrat eller gangliosider.

Fortsætter eksperimentel søgekriterier transdifferentiering af stamceller i knoglemarv stromale precursorceller i nervesystemet og levervæv. Forskernes opmærksomhed er fokuseret på kombinationer af differentieringsinduktorer og specialkonditioneringsmedier. Især til isolering af primær kultur med 10% føtalt kalveserum, knoglemarv stromale celler vasket og resuspenderet i DMEM / F12-dyrkningsmedium (1/1) podes ved en densitet på 200.000 / cm2. Efter 24 timer er vedhæftede celler fjernes og fastgøres til de plastiske fibroblast celler dyrkes i en uge. For differentieringen af stromale knoglemarvsceller til neuroblasts anvendt konditioneret medium opnås ved dyrkning tredages kultur af primært muse embryonale fibroblaster, samt blandt DMEM / F12 (1/1) med 2% føtalt kalveserum og suppleret med 20 ng / ml eller 10-6 M LiF retinsyre (neuroinductors, som anvendes til neural differentiering af mus og humane embryonale stamceller). Differentieringen af knoglemarv-stromaceller i progenitorceller til hepatocytter blev induceret konditioneret miljø skabt som et resultat af tre dages dyrkning af en primær kultur af embryoniske museleverceller i DMEM / F12 (1/1) medium suppleret med 10% føtalt kalveserum.

Her skal det bemærkes igen, at de kolonidannende celler i knoglemarvsstroma er heteromorfe og kan opdeles i to typer. Den første type indbefatter fibroblastlignende celler, der danner filopodia celler med store kerner og en eller to nukleoler. Den anden type er repræsenteret af små celler med en spindelformet form. I begge typer cellekultur i det konditionerede medium opnået på et fødelag af primær muse embryonale fibroblaster og på Z-4-th dag i kulturceller ligne neuroblasts. På dette stadium har de ofte en spindelformet form med en eller to lange processer, der slutter med filopodier. Pyramidale eller stellatceller med korte dendritter er mindre almindelige. Dendritterne én neuroblaster har typisk ekspansion (nyre vækst) og forgrening i sin distale del, den anden - med en distinkt vækstkegler filopodia, gennem hvilket sker dendritvækst. Lignende morfologiske træk (nyre vækstkegler og filopodia a) iboende neuroblastom, differentierer til neuroner, er beskrevet i detaljer i papirer med neurogenese. På dette grundlag konkluderer nogle forfattere, at de celler, de opdager i kultur, er neuroblaster. Især Schegelskaya E. Et al (2002), efter en primær kultur af stromale celler dyrket i to uger i en udskiftelig ved hver Z-og-4. Dag konditionerede medium fandt, at en del af de prolifererende celler, bevarer den udifferentieret tilstand. Udadtil så sådanne celler som fibroblaster og blev identificeret i kultur sammen med differentierende neuroblaster. De fleste af cellerne (ca. 80%) var i forskellige stadier af differentiering i celler i nervesvævet, hovedsagelig i neuroner. De dendritiske processer af disse celler kontaktede hinanden tæt, således at cellerne dannede sig gradvist på substratsektionerne i nervenettet i form af lange multicellulære tråde. Dendritiske processer af neuroblaster voksede meget længere, nogle af dem 8-10 gange højere end selve kroppen af neuronen. Efterhånden steg andelen af pyramidale og stellatceller. Dendrit af stellatceller forgrenet. Ifølge forfatterne, senere differentiering af pyramideceller og stjerneformige celler sammenlignet med tynde svarer til sekvensen af de normale stadier af neurogenese i dyr. Som et resultat, konkluderer forfatterne, at stamcellerne knoglemarvsstromalceller udsættes induceret neurogenese i hvilken fremgangsmåde in vitro genererede neuroblaster fra alle tre hovedtyper af neuroner. Precursorer for neurale celler blev også fundet i kulturen i knoglemarvsstromalceller i 3-4 dage i medium med 2% føtalt serum og 20 ng / ml LIF. Men i dette tilfælde blev stamcellerne opdelt meget langsomt, differentieringen af neuroblaster forekom kun i 30% af tilfældene, og de dannede ikke neurale netværk. Anvendelse som en nervecelle differentieringsfaktorer inducere retinsyre, forfatterne opnået i kultur til 25-30% af nervecellerne med en overvægt af gliaceller - astrocytter og oligodendrocytter. Neuroner tegnede sig kun for en tredjedel af alle nerveceller, selv om de var repræsenteret af alle tre typer: fusiform, pyramidale og stellatceller. På den 6. Dag i dyrkning stromaceller i retinsyre medium nerveceller blev mere differentierede, mens de enkelte axoner pyramidale neuroner blev konstateret, at i den normale neuroontogenesis vises senere dannelse af de dendritiske processer. Ifølge forfatterne, trods det lave udbytte af nerveceller, hvilken fremgangsmåde til at inducere retinsyre har fordele: astrocytter og oligodendrocytter og myelinerende operere foder funktioner under væksten af axoner og dendritter og er nødvendige for normal nerve vævsdannelse. Derfor er det bedre at bruge en suspension af neuroner beriget med glialceller for at reparere dets beskadigede steder in vivo.

I den anden serie eksperimenter forfatterne forsøgt at inducere differentiering af stromale knoglemarvsceller i levercellerne. Efter tre dages kultur af knoglemarvsceller stromale stamceller i det konditionerede medium opnået ved inkubering muse embryonale hepatocytter, er blevet fundet store, sfærisk formede celler, ofte to-nukleare, cytoplasmiske inklusioner med forskellige størrelser. Disse celler var på forskellige stadier af differentiering, og afveg i størrelse, antallet af kerner og cytoplasma inklusioner. I de fleste af disse celler blev detekteret glycogen, hvorved vi har identificeret dem som hepatocyt precursorceller. Da kulturen blev detekteret Svarende til neuroblasts ingen celler, efterfulgt af en konklusion, at i det konditionerede medium opnået ved dyrkning embryonale hepatocytter, der er ingen faktorer differentiering af nerveceller, og omvendt der er faktorer, der inducerer differentiering af stromale knoglemarvsceller i progenitorceller af hepatocytter . Forfatterne foreslår tilstedeværelsen af pluripotente celler fra knoglemarvsstroma, som de differentierer in vitro i celler fra lever- eller nervevæv afhængigt af de specifikke konditionerede medier, og induktionsspoler.

I nogle studier viser faktisk korrekt differentiering af stromale knoglemarvsceller i cardiomyocytter, bruskceller, knogle og nervevæv. Der er information om, at blandt cellerne i knoglemarvet er der populationer af stamceller, der kan differentiere i hepatocytter. I lyset af disse resultater over eksperimenter i mus kan stadig betragtes som en bekræftelse af tilstedeværelsen i knoglemarven pluripotente mesenkymale stamceller med evne til at differentiere til celler af forskellige væv i den voksne organisme.

Transplantation af mesenkymale stamceller

I klinisk transplantation af humane mesenkymale stamceller kan anvendes til ekspansion af hæmatopoietiske stamceller og deres tidlige efterkommere prekommitirovannyh. Især indførelsen af autologe hæmatopoietiske stamceller og MSC'er cancerpatienter efter kemoterapi ved høj fremskynder opsving i neutrofiler og blodplader i perifert blod. Autologe og allogene transplantation af mesenkymale stamceller anvendes til behandling af myelomatose, aplastisk anæmi, spontan trombocytopeni - sygdomme associeret med primær defekt hæmatopoietisk stromavæv. Effektiviteten af celleterapi i hæmatologiske patologier i mange tilfælde over, mens indførelsen af stromale og hæmopoietiske stamceller, som manifesterede en reduktion af den postoperative rekonvalescensperiode, blod, fald i antallet af dødsfald som følge af ikke-selektive destruktion regionale og cirkulerende cancerceller, hvor matricen og dens egen progenitor hæmatopoietiske patientceller. MSC'er lovende programmer og andre multipotente mesenchymale precursorceller i klinisk praksis på grund af deres relativt lette at opnå knoglemarvsaspirater, ekspansion i kultur og transfektion af det terapeutiske gen. Således at kompensere for lokale vævsdefekter kan bruge en lokal implantation af multipotente mesenchymale precursorceller og i systemisk dysfunktion af væv af mesenkymal oprindelse er ikke udelukket deres indføring i det generelle kredsløb.

Mere forsigtige i deres argumenter forfatterne af værker, hvor perspektiver MSC'er for lokal, systemisk transplantation og genterapi analyseres fra synspunkt biologi stromaceller. Postnatal knoglemarv er traditionelt betragtes som et organ sammensat af to systemer af distinkte cellelinier - faktisk hæmatopoietisk væv og dens tilhørende understøttende stroma. Derfor, knoglemarvsceller mesenchymstamceller oprindeligt kun betragtes som en kilde til stromal grundlaget for produktionen af regulatoriske faktorer hæmatopoietisk mikromiljø. Derefter skiftede forskernes opmærksomhed til at studere MSC's rolle som stamme af skeletvæv. De seneste data indikerer et uventet potentiale for differentiering af knoglemarvsstrømceller med dannelsen af et neuralt eller muskelvæv. Med andre ord, de mesenkymale stamceller udviser transgermalnuyu plasticitet - evnen til at differentiere til celletyper, at fænotypisk uoriginale vævsceller. Men nogle aspekter af biologien for stromale knoglemarvsceller fortsat uklare og uløste generelt biologisk plan, og i nogle detaljer, herunder identifikation, art og oprindelse og udvikling og funktion in vivo knoglemarvs stromale celler såvel som den tilladte potentielle differentiering ex vivo og muligheden terapeutisk anvendelse in vivo. De data om de potentielle muligheder for MSC'er, samt resultaterne af undersøgelser af andre regenerativ potentiale af stamceller, i skarp kontrast med den etablerede dogme i biologi.

Når de dyrkes under lavdensitetsbetingelser, udgør knoglemarvsstamstromceller forskellige kolonier, der hver især er et derivat af en enkelt precursorcelle. Procentdelen af stromale celleprecursorer i nukleerede knoglemarvsceller defineret ved deres evne til at danne kolonier i høj grad afhænger af dyrkningsbetingelser og arterne af MSC'erne tilhører. For eksempel i gnaveren for at opnå den maksimale mængde af stromale stamceller er absolut nødvendigt i nærværelse af bestrålede feeder kultur af knoglemarvsceller og serum, medens kolonidannelseseffektivitet af humane mesenkymale stamceller er uafhængig af feeder, eller fra dyrkningsmediet. Antallet af kendte mitogene faktorer, der stimulerer proliferationen af stromal progenitorceller, er begrænset. Disse indbefatter PDGF, EGF, FGF, TGF-b og også IGF1. Under optimale betingelser, dyrkning MSC'er polyklonale linier opretholdt in vitro i mere end 50 celledelinger, hvilket gør det muligt at modtage de milliarder af knoglemarvsstromalceller fra 1 ml aspirat det.

Imidlertid populationen af stromale knoglemarvsceller er heterogent, som manifesterer sig som variabilitet i størrelsen af kolonierne, forskellig hastighed af deres dannelse og en række cellemorfologi, som omfatter en række fibroblastlignende spindel til store flade celler. Med udviklingen af sådanne afgrøder efter 20 dage er fænotypisk heterogenitet også bemærket. En del af kolonien er kendetegnet ved høj ekspression af alkalisk phosphatase, mens andre ikke udtrykke det, og den tredje type kolonier er fosfatazopozitivnymi i den centrale region og fosfatazonegativnymi i periferien. Separate kolonier danner knudervæv knudevæv (begyndelsen af matrixmineralisering er markeret, når den er farvet med alizarinrød eller på calcium fra Van Koss). I andre kolonier finder fedtopbygning sted, identificeret ved G-farvning med olierød. Mindre ofte udgør kolonierne i de mesenkymale stamceller brusker, der er farvet med alcyanblåt).

Efter ektopisk transplantation i forsøgsdyr polyklonale MGK linier danner ektopisk knogle stroma med setchatoobraznoy forbundet med myelopoiesis og adipocytter, samt, men sjældent, med bruskvæv. I monoklonalt linjer transplantation af stromale knoglemarvsceller i nogle tilfælde der kimærisme, hvor de novo dannet knoglevæv er sammensat af knogleceller, adipocytter omfatter stroma og donor oprindelse, hvorimod cellelinier af hæmatopoietisk og karsystemet er afledt af modtageren.

Resultaterne af disse undersøgelser bekræfter stammen naturen af stromal knoglemarvsprecursoren, hvorfra klonlinien blev opnået. De viser også samtidig, at ikke alle kloning i kulturceller er faktisk multipotente stamceller. Nogle forskere mener, og vi deler deres mening, at der kun kan opnås den mest præcise oplysninger om den reelle potentiale differentiering af individuelle kloner in vivo efter transplantation, snarere end ved at bestemme fænotype af deres derivater in vitro. Ekspression i osteo- kultur fænotypiske markører hondro- eller adipogenese (bestemt ved mRNA eller via histokemiske metoder), og selv fremstilling af mineraliseret matrix afspejler ikke graden af pluripotens enkelt klon in vivo. Derfor er identifikationen af stamceller i stromacellegruppen kun mulig efterfølgende under de egnede betingelser for en biologisk transplantationstest. Især chondrogenese meget sjældent observeret i transplantationssystemerne åbne systemer, hvorimod dannelsen af brusk er ikke ualmindeligt i lukkede systemer, såsom diffusionskamre eller i mikromassnyh kulturer af stromaceller i vitro, hvor nået lokalt lav spænding oxygen, bidrager til dannelsen af brusk. Derfor påvirker selv transplantationsteknikken såvel som uspecifikke dyrkningsbetingelser in vitro signifikant omfanget af MSC-differentiering.

Eksperimentel transplantation med overholdelse af givne eksperimentelle betingelser er den gyldne standard til bestemmelse af potentialet for differentiering af knoglemarvsstromceller og nøgleelementet i deres korrekte identifikation. Historisk er knoglemarvstromme knoglemarvstransplantationsundersøgelser forbundet med et fælles knoglemarvstransplantationsproblem. Det blev fastslået, at hæmopoietisk mikromiljø er skabt ved transplantation af knoglemarvsstromceller og tilvejebringer ektopisk udvikling af hæmopoietisk væv i transplantationszonen. Kan betragtes fra værten som et sandt ektopisk knogle "inverteret" knoglemarvstransplantation - oprindelsen af mikromiljøet af donoren og hæmatopoietisk væv. Lokal transplantation af knoglemarvsstromaceller fremmer effektiv korrektion af knoglefejl, mere udtalt end ved spontan reparativ regenerering. I flere prækliniske undersøgelser med dyremodeller vist sig overbevisende muligheden for transplantater af stromale knoglemarvsceller i ortopædi, selvom at optimere disse fremgangsmåder, selv i de simpleste tilfælde kræve den mest omhyggelige arbejde og analyse. Navnlig optimale betingelser for ekspansion ex vivo osteogene stromaceller endnu ikke er sat, ingen udstødning struktur og sammensætning er ideelle bærer og antallet af celler, der er nødvendige for regenerering af knogle volumen.

Ud over at anvende opformeret ex vivo knoglemarvs stromale celler til vævsregeneration af mesenchymal oprindelse utraditionelt duktilitet MSC åbner den potentielle anvendelse til regenerering af neurale celler eller levering af genprodukter i CNS. Dette forenkler i princippet cellulær terapi i nervesystemet, da der ikke er behov for at opnå autologe neurale stamceller fra mennesker. Det er rapporteret om mulighederne for at anvende knoglemarvsceller til generering af cardiomyocytter og myogene precursorceller som en virkelig stromal og ekstrinsisk oprindelse.

Eksperimenter pågår ved systemisk transplantation af knoglemarvsstromceller til behandling af almindelige skjoldsygdomme. Ingen tvivl om, at knoglemarv stromale celler er en population ansvarlig for genetiske sygdomme i sygdomme i skelet, som er godt illustreret af vektoren overførsel ved hjælp af genetiske information i cellerne, hvilket fører til dannelsen af patologiske knoglevæv hos forsøgsdyr. Imidlertid er stromacells evne til at implantere, vokse, formere sig og differentiere i skeletets knogler efter indføring i den generelle blodstrøm endnu ikke blevet bevist.

Dette skyldes til dels det faktum, at den normale procedure af knoglemarvsstroma ikke transplanteres med hæmatopoietisk væv, så strenge kriterier for evaluering vellykket transplantation af systemisk indgivelse af stromale celler har endnu ikke udviklet. Man bør huske på, at tilstedeværelsen af markørgener i vævsekstrakter eller isolationen i cellerne fra donor-oprindelse indikerer ikke om engraftment af celler, men kun deres overlevelse. Selv intraarteriel injektion af stromale knoglemarvsceller i muse lem kan føre til næsten nul resultat indpodning, til trods for at donorafledte celler findes i stort antal inden for mikrovaskulære knoglemarv netværk. Desværre beskrives sådanne celler normalt som "engrafted" kun på basis af resultaterne af bestemmelsen af markør-donorgener under dyrkningsbetingelser ex vivo. Derudover er det nødvendigt at fremlægge overbevisende beviser for langsigtet integration i væv fra differentierede og funktionelt aktive celler af donor oprindelse. I mange offentliggjorte værker er der manglende klare data af denne art, der rapporteres om engraftment af knoglemarvsstromceller i skeletet. Dog skal det bemærkes, at der i nogle korrekte dyreforsøg virkelig sat selvom begrænset, men den virkelige heling af stromale stamceller efter systemisk administration.

Disse data er i overensstemmelse med resultaterne af undersøgelsen af muligheden for at levere myogene knoglemarvsprecursorceller til musklerne gennem vaskulærsystemet. Det bør dog ikke glemmes, at både skelet og muskelvæv dannes under udvikling og vækst på basis af ekstravaskulære cellebevægelser, der bruger migrationsprocesser, der ikke indebærer blodcirkulation. Hvis der faktisk er en uafhængig omløbsbane for levering-predshestvonnrshov celler i fast fase væv, er det muligt at forhindre forekomsten af fysiologisk cirkulerende mesenkymale stamceller? Hvad er oprindelsen af disse celler i både den udviklings- og postnatale organisme, og hvordan trænger de ind i vaskulærvæggen? Løsningen af disse spørgsmål er absolut nødvendig og kræver den mest grundige prækliniske analyse. Selv efter at svarene på disse spørgsmål er fundet, forbliver de problematiske kinetiske aspekter forbundet med skeletvækst og remodeling af bindevæv uløst. Samtidig synes behandling af osteogeneseforstyrrelser ved at erstatte hele populationen af muterede skeletprogenitorceller med sunde stromalceller at være et reelt klinisk perspektiv. I dette tilfælde kan lokal deformation eller brud på grund af zone osteogenese og knogle patologiske destruktive ændringer korrigeres ved anvendelse af in vitro dyrkede stromale stamceller. Derfor bør retningen for fremtidig forskning fokuseres på problemerne med transformation eller genetisk korrektion af autologe muterede osteogene stamceller ex vivo.

Gensplejsning af celler, midlertidigt eller permanent, blev grundlaget for celle- og molekylærbiologi, kilden til mange videnskabelige oplysninger om den rolle individuelle proteiner i cellulær metabolisme in vitro stoffer og in vivo. Anvendelsen af molekylære teknikker til at korrigere arvelige sygdomme og humane sygdomme er meget lovende for praktisk medicin, eftersom egenskaberne af stromale stamceller fra knoglemarv lov til at udvikle unikke kredsløb transplantation til korrektion af genetiske sygdomme i skelettet. I dette tilfælde kan de mesenkymale stamceller kan opnås ganske let fra den kommende modtager, de er modtagelige for genetisk manipulation og er i stand til at yngle i stort tal i en kort periode. Brugen af mesenkymale stamceller undgår de begrænsninger og risici, der er forbundet med leveringen af genetisk informationsmateriale direkte til patienten via vtruva vektorstrukturer. Denne strategi er anvendelse på pi embryonale stamceller, men postnatal autologe knoglemarvsstromaceller - et foretrukket materiale, fordi deres administration udelukker eventuelle immunologiske posttransplantation komplikationer. For at opnå kortvarig effekt, for eksempel for at fremskynde knogleregenerering, den optimale metode er den genetiske modifikation af mesenkymale stamceller under anvendelse elektroporatsrsh, kemiske fusion, lipofektion, plasmider og adenovirale konstruktioner. Specielt viral transfektion i BMM-2-celler fra knoglemarvsstrøm var effektiv til acceleration af regenerering af knogler i eksperimentel polytrauma. Oprettelse af adenovirale vektorkonstruktioner foretrækkes på grund af fraværet af toksicitet. Imidlertid er den genetiske modifikation af knoglemarvsstromceller karakteriseret ved ekstremt lav stabilitet. Endvidere normale transformerede knoglemarv stromale celler kræver anvendelse af vektor bærere af genetisk information 10 gange mere smitsom end andre celletyper, hvilket øger procentdelen af død af de transficerede celler.

Til behandling af recessive sygdomme forårsaget af lav eller nul biologiske aktivitet af visse gener nødvendige langvarig eller permanent ændring af mesenkymale stamceller, som kræver anvendelse af adenoassocierede vira, retrovira, lentivira og adeno-retroviral kimære. Transportsteder af disse vira er i stand til at transportere store DNA-transfekter (op til 8 kb). Den videnskabelige litteratur har allerede vist information om biologisk aktivitet af exogene knoglemarvsstromaceller transficeret med retrovirale konstruktioner, der koder for syntesen af regulatoriske molekyler og markører - IL-3, CD2, faktor VIII, og de er involveret i syntesen af L-DOPA-enzymer. Men selv i disse papirer, forfatterne peger på en række begrænsninger, der skal overvindes før starten på den praktiske anvendelse af denne teknologi. Det første problem er at optimere MCK ex vivo modifikationsprocessen. Det er kendt, at langvarig (3-4 uger) in vitro proliferation af stromacellerne i knoglemarven formindskes deres transficeret. Samtidig kræves der flere transfusionscykler for at opnå et højt niveau af genetisk modifikation af MSC'er. Det andet problem er relateret til varigheden af ekspression af det terapeutiske gen, som endnu ikke overstiger fire måneder. Et naturligt fald i effektiv genekspression skyldes inaktivering af promotorer og modificerede cellers død. Generelt udsigter overførsel af genetisk information ved anvendelse af mesenkymale stamceller resultaterne af præliminære studier indikerer behovet for yderligere optimering af transfektionsmetoder ex vivo, vælge en passende promotor regulerer den biologiske aktivitet i den rigtige retning, og øge effektiviteten af de modificerede knoglemarvs stromale celler til selvfornyelse in vivo efter transplantation. Det skal bemærkes, at anvendelsen af retrovirale konstrukter til modifikation af stromale knoglemarvsceller i den ønskede retning ikke altid kræver deres obligatoriske indpodning. Transficerede mesenchymal stamcelle kan udføre en korrigerende funktion på baggrund af stabil og ophold uden at kræve aktiv fysisk inkorporering og fungerer i bindevævet. I dette tilfælde bør de betragtes som en biologisk minipumpe, der producerer in vivo faktor, manglende som bestemmer manifestation af en genetisk sygdom.

Anvendelse af transformerede knoglemarvs stromale celler til behandling af dominant genetisk sygdom, der er karakteriseret ved ekspressionen af genet eller unormal patologisk biologisk aktivitet, er langt mere problematisk, fordi i dette tilfælde er det nødvendigt at blokere overførslen eller salg af den genetiske information forvrænget. En af metoderne til gensplejsning - homolog rekombination af embryonale stamceller til at danne transgene dyr. Men det ekstremt lave niveau af homolog rekombinant, kombineret med problemerne med identifikation, separation og udvidelse af sådanne rekombinanter er usandsynligt at fremme udbredt anvendelse af denne teknik i den nærmeste fremtid, selv om udviklingen af nye teknologiske metoder. Den anden fremgangsmåde til genterapi er baseret på den dominerende patologi automatisk korrektion af beskadigede DNA som genetiske mutationer kan korrigeres ved indføring af det exogene DNA med den ønskede sekvens (korte DNA-oligonukleotider, eller kimære RNA / DNA-oligonukleotider), der binder til homologer i den beskadigede genom. Den tredje udførelsesform tilvejebringer patologisk information transmission lås, der opnås ved anvendelse af specielt designet oligonukleotider, som binder til et bestemt gen til dannelse ternære spiralformet struktur, som udelukker muligheden for transkription.

Skønt korrektion af genetiske sygdomme i genomet niveau er optimalt og foretrukken terapeutisk fremgangsmåde, mRNA er også en lovende vektor (måske endnu mere tilgængelig) til blokering en dominant negativ gen. For at inhibere translation og / eller forøge mRNA-nedbrydning har længe været brugt med proteinmolekyler Antisense oligonukleotidsekvenser eller fuld blokering binding af mRNA biosynteseapparatet af cellen. Derudover inducerer dobbeltstrenget RNA hurtig nedbrydning af mRNA, hvis mekanisme forbliver uklar. Det er imidlertid usandsynligt, at den blotte fjernelse af mRNA transkriberet fra en mutant allel med korte eller enkelte mutationer vil fremme mRNA-ekspression af den normale allel. Et alternativ er brugen ribozinov hammerhoved og hårnål, har evnen til at binde til meget specifikke steder af mRNA med efterfølgende induktion af deres spaltning og inaktivering under translation. I øjeblikket studeres muligheden for at anvende denne metode til behandling af patologisk osteogenese. Uanset hvad er målet - genomiske eller cytoplasmatiske elementer vellykket ny genterapiteknologi vil blive bestemt af effektiviteten af optagelsen af reagenser i knogle marvstromaceller ex vivo, den optimale valg af en bestemt vektor og stabil evne mesenkymale stamceller, der udtrykker de ønskede faktorer in vivo.

Opdagelsen af mesenkymale stamceller med deres uventede egenskaber skaber således en ny konceptuel ordning for udvikling af cellelinjer. Men for at forstå den biologiske rolle af stromale stamceller af deres art, evnen til at transdifferentiering eller dedifferentieringen, deres fysiologiske betydning i processen med embryonale udvikling, postnatal vækst, modning og aldring, såvel som i humane sygdomme kræver yderligere tværfaglig forskning.