Myg med indbygget 'genetisk skjold' stopper malaria - infektionsraterne falder med 93%

Overvindelse af insekticidresistens: Hvordan en enkelt genmodifikation hos myg spreder sig selv på tværs af generationer og praktisk talt eliminerer malariasmitte uden at gå på kompromis med overlevelsen.

I et nyligt offentliggjort studie i Nature undersøgte et forskerhold, om glutamin 224 (Q224) allelen i fibrinogen-relateret protein 1 (FREP1) gør Anopheles stephensi-myg resistente over for Plasmodium-infektion, estimerede overlevelsesomkostningerne forbundet med denne allel og testede et allelisk gendrivesystem til at sprede denne beskyttende mutation gennem populationer.

Forudsætninger

Omkring 600.000 mennesker døde af malaria i 2023, hovedsageligt børn i Afrika syd for Sahara og Sydasien. Traditionelle bekæmpelsesmetoder – myggenet, insekticidbehandlinger, malariamidler – mister deres effektivitet på grund af resistens hos myg og parasitter. Gendrevne teknologier, der spreder gavnlige alleler gennem myggepopulationer, tilbyder en lovende og bæredygtig løsning.

FREP1-proteinet hjælper parasitter med at krydse myggens mellemtarm, men den naturlige variant Q224 kan forhindre infektion uden at kompromittere myggens biologi. Målet var at teste, om en sådan endogen allel kunne distribueres sikkert for at reducere malariaoverførsel, samtidig med at myggens levedygtighed opretholdes.

Om studiet

Ved hjælp af CRISPR/Cas9 blev der skabt to stammer af Anopheles stephensi, som kun adskilte sig i den 224. aminosyre i FREP1-proteinet: en vildtype med leucin (L224) og en potentielt beskyttende stamme med glutamin (Q224). Guide-RNA'et målrettede en intronregion 126 bp opstrøms for codonet, hvilket muliggjorde homolog rekombination med indsættelse af et fluorescerende mærke (GFP eller RFP).

Fitness blev vurderet ud fra vingelængde, frugtbarhed, ægklækningsevne, forpupning, fremkomst af voksne æg og levetid (Kaplan-Meier overlevelsesanalyse).

Vektorkompetence blev bestemt ved hjælp af standard membranfodring af Plasmodium falciparum (menneske) og Plasmodium berghei (gnaver) parasitter, med oocyst- og sporozoittællinger i spytkirtler.

Allel-drivsystemet omfattede en kassette med gRNA mod L224 og Cas9 under kontrol af vasa-promotoren. Allelfrekvenser blev overvåget ved hjælp af fluorescerende tags i multicyklusforsøg (10 generationer). Genotypning blev udført ved hjælp af PCR, Sanger-sekventering og NGS. Bayesiansk modellering estimerede allelkonvertering, fitnessomkostninger og dynamik under fri parring i laboratoriet.

Resultater

FREP1Q224-allelen forårsagede ikke signifikante tab i overlevelse: vingelængde, frugtbarhed, klækning, forpupning og fremkomst af voksne dyr var identiske med FREP1L224-kontrollen. Små forskelle i hannernes størrelse og levetid påvirkede ikke konkurrenceevnen. Jomfruelige FREP1Q224-hunner levede lige så længe som kontrolgruppen, og hunnerne efter blodfodring viste kun et lille fald i levetid.

Udfordringsforsøg viste markant beskyttelse hos homozygoter.

• Ved lave koncentrationer af P. falciparum gametocytter (0,08%):
  • Infektionsraten faldt fra 80 % til ~30 % i FREP1Q224;
  • Gennemsnitligt antal oocyster: fra 3 til 0;
  • Sporozoitter i spytkirtler: fra >4000 til 0.
• Ved højere gametocytæmi (0,15%):
  • Gennemsnitligt antal oocyster: fra ~32 til
  • Sporozoitter faldt også dramatisk.
• For P. berghei:
  • Gennemsnitligt antal oocyster: fra 43 til 25;
  • Sporozoitter: fra ~19.000 til 11.000.
• Heterozygoter (FREP1L224/Q224) var ikke beskyttet.

Gendrevseffektivitet

• I parrede krydsninger konverterede Cas9 + gRNA L224 50 til 86% af FREP1L224-allelerne til FREP1Q224;
• Med moderlig Cas9 var hyppigheden højere;
• I 2. generation nåede hyppigheden af den beskyttende allel 93%;
• Forekomsten af NHEJ-reparationsvejsfejl var lav (0-12%) og forårsagede typisk skade.
• I cellepopulationer med et donor:recipient-forhold på 1:3 steg FREP1Q224-frekvensen fra 25 % til >90 % over 10 generationer;
• Hyppigheden af NHEJ-alleler faldt fra 5,4 % til

Bayesiansk modellering understøttede hypotesen om høj konvertering, lav frekvens af stabile mutationer og en dødelig steril mosaicisme-effekt, hvor WT-homozygoter med den maternelle Cas9-genotype led af somatiske mutationer og reduceret overlevelse.

Senere generationer viste næsten fuldstændig undertrykkelse af P. falciparum-oocyster (median 0 til 5,5), hvilket bekræftede, at populationen stort set var blevet modstandsdygtig over for parasittransmission.

Den beskyttende allel havde ingen skjulte fordele eller bivirkninger og blev spredt via drive.

Konklusioner

Undersøgelsen viste, at udskiftning af en enkelt aminosyre i FREP1-proteinet og ændring af dets arv ved hjælp af et gendrev kunne gøre Anopheles stephensi stort set immun over for malaria – både mennesker og gnavere – uden at kompromittere myggenes levedygtighed.

Denne tilgang supplerer eksisterende foranstaltninger (net, insekticider, lægemidler), hvis effektivitet reduceres af resistens. Et sådant system kan også bruges til at genoprette følsomheden over for insekticider eller introducere andre beskyttende alleler.

Før teknologien kan implementeres, er der behov for strenge miljømæssige, etiske og forvaltningsmæssige rammer samt systemer til kontrol af spredning.